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(無題) 削除/引用 No.7922-12 - 2019/05/29 (水) 18:20:39 - Cell number 顕微鏡で観察してみて、見た目の細胞の数とMTS assayのデータは対応していますか。細胞数的には大差ないように見えるのにMTSの結果はかなり差があるとかいうことはないですか。個々の細胞のエネルギー代謝に基づくものであり、必ずしも細胞数を正確に反映しない場合も起こりうることは十分考慮する必要があります。特に実験系が仮に間接的であれエネルギー代謝やミトコンドリア、細胞内のレドックス等に影響を与えることが懸念されるならばMTSやMTT法は避けるべきです。もちろんそういうデータはcell countとは別に重要な知見にはなると思いますが。 24-wellとか3-cm dishとかもう少し大きなスケールで培養して、縦軸を細胞数およびMTSassayの吸光度、横軸に細胞数として増殖曲線を描いてみると、扱っている細胞や今の実験系にとってMTSassayが妥当かどうかわかります。面倒ですし古典的ですが、トリパンブルー染色して計算版とカウンターでCell countするのが確実です。

(無題) 削除/引用 No.7922-11 - 2019/05/29 (水) 05:42:59 - おお 撒く数を減らせば日ごとの細胞あたりのMTT活性が変動しないことを担保できますか？まずそこを見ないといけないかと思うのですけど。ところで細胞株（株とは限らないでしょうけど）の名前とか開示できますか？

(無題) 削除/引用 No.7922-10 - 2019/05/29 (水) 02:27:27 - cell 1-5%とかで細胞まけばいいと思う 最終的に100%にする必要ないし 培地の交換すると、交換する前後で細胞の調子が変わって、不連続なグラフになりそう

(無題) 削除/引用 No.7922-9 - 2019/05/29 (水) 01:37:16 - おお いや、それより違う方法を取るほうがいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.7922-8 - 2019/05/28 (火) 13:02:13 - 悲しみの男 皆様ご返信ありがとうございます。 確かに細胞数を減らしてみます。また2日目での培地交換も試してみようと思っております。 MTSは2時間でインキュベートし、測定後は廃棄しております。 プレート5枚用意し、直後〜4日目と測定しておりました。 細胞は観察した感じでは特に細胞数のばらつきはなく均等に播けていたと思います。

(無題) 削除/引用 No.7922-7 - 2019/05/28 (火) 08:34:19 - TS MTS試薬を4日間いれっぱなし、ではないですよね？

(無題) 削除/引用 No.7922-6 - 2019/05/28 (火) 04:28:49 - おお 細胞の生理状態が変化しているゆえ細胞あたりの活性が変わっているのでしょう。いつもこの類の実験で不思議に思うのは違う日におこなったMTTの値をどう比べるかということです。流石に２倍は変わらないでしょうけど。 ＞日がたつとﾌｪﾉｰﾙﾚｯﾄﾞ指示薬が黄色になって、それが発色を干渉していたりしませんか？ どうでしょうね。最終的には酸性に振ってﾌｪﾉｰﾙﾚｯﾄﾞの色が邪魔しない状況で吸光度をそくていするので

(無題) 削除/引用 No.7922-5 - 2019/05/27 (月) 23:16:16 - み オーバーコンフルエントになった時点で栄養が足りてなくて死のスイッチが入っているのでしょう。 タブリングタイムが24hとしても、30%でまいたら2日後には120%ですか。細胞の状態、ﾐﾄｺﾝﾄﾞﾘｱ代謝活性が低下してMTTなどでは正確に細胞数を反映しないのは当たり前かと。 10%でまいても増殖が速い細胞なら3、4日まで増加が観察できれば良い感じではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7922-4 - 2019/05/27 (月) 22:40:21 - 悲しみの男 すいません、文字化けしてしましました。 最初は10000cellsで次は4000cellsで播きました。

(無題) 削除/引用 No.7922-3 - 2019/05/27 (月) 22:38:22 - 悲しみの男 ご回答ありがとうございます。とても参考になります。 見た目での細胞数は2日目までは増加は認めましたが 3、4日目では変化なさそうでした。 細胞は生存しておりました。 確かに、4日目で培地の色がやや薄くなっていたような印象はありました。 指示薬なしの培地は所持しておりませんが、購入検討してみます。 細胞はヒト舌腫瘍細胞株を使用しております。 当初、1×10⁴/welで行いましたが3日目にオーバーコンフルとなり4日目に細胞が1部死んでいましたため、今回4×10³で行いました。しかしながら、1日目が30％コンフルと薄い印象を受けました。 現在次の対策としては細胞数を少し増やすという事しか思い浮かびません。 吸光度の測定試験に培地交換などは行うものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7922-2 - 2019/05/27 (月) 22:15:18 - み 見た目で細胞数は増加していますか？ 生存に問題はないですか？ 日がたつとﾌｪﾉｰﾙﾚｯﾄﾞ指示薬が黄色になって、それが発色を干渉していたりしませんか？ 指示薬なしの培地で解決しませんか？ ﾐﾄｺﾝﾄﾞﾘｱ代謝活性を指標とする方法が通用する細胞種ですか？日毎に分化していったり細胞が変化するようでは単純に細胞数の変化を反映させられない。

96ウェルに播いた細胞の細胞数減少 削除/引用 No.7922-1 - 2019/05/27 (月) 21:58:15 - 悲しみの男 お世話になります。現在細胞増殖アッセイを行っております。 96ウェルプレートに細胞をまいて4日間、MTSアッセイにて吸光度を測定しております。3日目、4日目になると2日目よりも吸光度が半分ほどに減少してしまいます。原因として培地交換していないからかと考えたのですが、他に考えられる原因等ございますでしょうか？ ご教授頂ければ幸甚です。

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