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(無題) 削除/引用 No.7921-9 - 2019/05/28 (火) 05:08:05 - おお The EEV technology outperformed the other episomal platforms by at least 10-fold over the course of these studiesup to 21 days post-HDD injection (not shown).This demonstrates the ability of the EEV platform to provide sustained, long-lasting transgene expression which is critical for endpoint studies requiring weeks or even months of transgene expression. https://www.systembio.com/wp-content/uploads/EEV-User-Manual-1.pdf このあたりとか、そのリファレンスを探ってみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7921-8 - 2019/05/28 (火) 04:14:45 - おお 要するに一つのプラスミドに恒常的に発現するEBNA1、EBori、興味ある遺伝子を発現するためのプロモーターからPolyAまでの発現ユニットが載っているプラスミドを使っているということだと思います。私が知っているベクターは更にその上に薬剤耐性マーカーが入ってましたので、薬剤耐性マーカーにより、プラスミドがIntegrateしたものよりもっと多くの細胞が生き残り導入後すぐに細胞が使えるのかなと思ってました。 おそらくそのへんのキャラクタライズはこういうベクターを構築したりしたときにされているだろうから検索してみるといいかと。

(無題) 削除/引用 No.7921-7 - 2019/05/28 (火) 00:36:58 - Z >[Re:6] APさんは書きました : > 大腸菌のプラスミドやF'エピソームなども選択がかからなければ「落ちる」っていうでしょ。増殖性があってハイコピーなプラスミドですらそうです。 > あたしの理解するところ、 > プラスミドは染色体と違って娘細胞に均等に分配するメカニズムがなくて、細胞質分裂で偶然に振り分けられるだけ。そうするとプラスミドを多く含む娘とあまり含まない娘、さらにはプラスミドがまったく入らなかった娘とゆらぎが生じる。エピソーマルベクターに自己増殖oriがあろうとなかろうと、特段の機構なしで偶然によるが、いずれは確実に「落ちた」細胞を生じ、そのうちにそればかりになる。 プラスミドの話にすり替わってるw > > 大腸菌でいうプラスミドの不和合性というのも同じように特段の機構はなく偶然によって必然的に（？）生じるんだよね。 > 同じoriをもつ異なるプラスミドが同じ細胞に同時に存在すると、いずれはどちらか一方が「落ちて」、一方のみを保持するようになる（見かけ上、同じoriの異なるプラスミドを有した細胞は生じない）。 > > >特に薬剤誘導性にEBNA1が発現するわけではなさそうなのですが、 > ちょっと何言ってんのかわからない。 小馬鹿にしてるw

(無題) 削除/引用 No.7921-6 - 2019/05/27 (月) 17:19:30 - AP 大腸菌のプラスミドやF'エピソームなども選択がかからなければ「落ちる」っていうでしょ。増殖性があってハイコピーなプラスミドですらそうです。 あたしの理解するところ、 プラスミドは染色体と違って娘細胞に均等に分配するメカニズムがなくて、細胞質分裂で偶然に振り分けられるだけ。そうするとプラスミドを多く含む娘とあまり含まない娘、さらにはプラスミドがまったく入らなかった娘とゆらぎが生じる。エピソーマルベクターに自己増殖oriがあろうとなかろうと、特段の機構なしで偶然によるが、いずれは確実に「落ちた」細胞を生じ、そのうちにそればかりになる。 大腸菌でいうプラスミドの不和合性というのも同じように特段の機構はなく偶然によって必然的に（？）生じるんだよね。 同じoriをもつ異なるプラスミドが同じ細胞に同時に存在すると、いずれはどちらか一方が「落ちて」、一方のみを保持するようになる（見かけ上、同じoriの異なるプラスミドを有した細胞は生じない）。 >特に薬剤誘導性にEBNA1が発現するわけではなさそうなのですが、 ちょっと何言ってんのかわからない。

(無題) 削除/引用 No.7921-5 - 2019/05/27 (月) 17:16:38 - toto EBNA-1の役割について、これとOriPを持つベクターはかつてInvitrogenが出していたpRep9などいくつかあり、私もstable発現に使ったこともあって、興味は持ってましたが、今ではmomさんの言われるような結論になったのですか？EBNA-1がほんとにプラスミド複製において役割は果たしてるのかという論文が昔出ていて、どうなんだろうと思ってました。 以前は、つまり、このベクターを出していたメーカーの説明や、（おそらくS&Bさんが参照された）山中先生らの2013年の論文では、この2つがあることで、細胞が複製するときにエピソーマルにプラスミドも複製されて、ゲノムへのintegrationが起きずに、プラスミドが一定量いつまでも存在する、となっていました。この系でstableな細胞は取れますが、ほんとにゲノムへのintegrationが起きてないのかは調べてません。山中先生らは調べられたのかな。

(無題) 削除/引用 No.7921-4 - 2019/05/27 (月) 15:57:09 - mom EBNA1がOriPを持つプラスミドだとすると、EBNA1のプロモーターがメチル化などによって発現が徐々に減衰する事を利用しているのかな？

(無題) 削除/引用 No.7921-3 - 2019/05/27 (月) 14:23:49 - S&B mom様、書き込みを有難うございます。 実はコラボレータからのプラスミドで、EBNA1がOriPを持つプラスミド (4 factorsも含有)に組み込まれているんです。 mom様のEBNA1とOriPプラスミドが別々というなら分かりやすいのですが・・・ なぜこのようなデザインになっているのかが疑問です。。。 >[Re:2] momさんは書きました : > EBNA1を発現するプラスミドは複製しないので、細胞が増殖するにつれて細胞内から無くなっていきます。 > EBNA1タンパクがないとOriPプラスミドも複製できないので、これも細胞内から無くなっていきます。 > EBNA1タンパクの減少は（おそらく）EBNA1プラスミドの減少より遅いので、OriPプラスミドの消失は、EBNA1プラスミドの消失より遅いと考えられます。 > すなわち、細胞の初期化には十分な時間（１週間程度？）、OriPプラスミドは細胞内に存在すると思われます。

(無題) 削除/引用 No.7921-2 - 2019/05/27 (月) 14:06:41 - mom EBNA1を発現するプラスミドは複製しないので、細胞が増殖するにつれて細胞内から無くなっていきます。 EBNA1タンパクがないとOriPプラスミドも複製できないので、これも細胞内から無くなっていきます。 EBNA1タンパクの減少は（おそらく）EBNA1プラスミドの減少より遅いので、OriPプラスミドの消失は、EBNA1プラスミドの消失より遅いと考えられます。 すなわち、細胞の初期化には十分な時間（１週間程度？）、OriPプラスミドは細胞内に存在すると思われます。

エピソーマルベクターはいつかは細胞から無くなるのか 削除/引用 No.7921-1 - 2019/05/27 (月) 11:07:02 - S&B お世話になります。 iPSの樹立目的にエピソーマルベクターを使用したいです。 EBNA1, OriPのシステムです。 原理はわかりますが、これは遺伝子導入された細胞はずっとこのプラスミドを持つのでしょうか？特に薬剤誘導性にEBNA1が発現するわけではなさそうなのですが、どう理解したらいいでしょうか？

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