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(無題) 削除/引用 No.7917-7 - 2019/05/28 (火) 02:52:53 - Zach TMさん、ありがとうございます！ 私はマウス血小板を対象にしています。 CSTのY519/520（Y525/526 in human）リン酸化抗体（＃2711）ではコラーゲン刺激有無に関わらず、3つのバンドが出現し、どれも強さ的に同じくらいです。その3つのうち、一つが70kDですが、これもロングエクスポーズすることで3本見えるようになります。 一昨日、＃2710（Y346 (Y352 in human)）を試したところ、70kDに非常に強いバンドが一つ認められました。以上のことから、非情に特異的であると考えています。 ただ、コラーゲン刺激の有無に関わらず、また差もなかったので、血小板のプレパレーションに問題ありそうですがそれはまた別の話になりますので、ここでは抗体の特異性にのみ言及してお話ししたいです。 あるいはTMさんが仰られるように、恒常的にリン酸化が起きている場所なのかもしれませんが、ペーパーをレスティング血小板ではバンドは出ていないので、おそらく私の血小板がよくなかったのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.7917-6 - 2019/05/27 (月) 09:56:16 - TM 実は、私も#2701と#2711、両方テストしました（マウスの細胞です）。結果、#2701は問題なかったのですが、#2711ではバンドが全然出ませんでした。Y346 (Y352 in human)のリン酸化は恒常的に起きているのだろうと推論して、そのままになっています。 ”Species predicted to react based on 100% sequence homology: Mouse, Rat”が意味するところは、「配列から考えるとマウスでも使えると思うけど、CSTでは確認していない」といった感じで、マウスでも行ける可能性が高いので、私の細胞でも試してみました。Y519/520（Y525/526 in human）のリン酸化が検出できなかった理由は、リン酸化そのものが起きてなかったのだろうと考えています。抗体の問題ではないと思っていますが、バンドが検出できてないので、特異性などについてはコメントできないです。

(無題) 削除/引用 No.7917-5 - 2019/05/27 (月) 08:45:18 - Zach tMさんありがとう！ 実は私もうまくいきました。ホッとしています。 一つ追加で質問させてくださいませ。 cellsignal.com/products/primary-antibodies/phospho-syk-tyr525-526-antibody/2711v Phospho-Syk (Tyr525/526) Antibody #2711 これの反応性はヒトのみのようです。 ところが、Species predicted to react based on 100% sequence homology: Mouse, Rat と混乱することが書かれてあります。 私も幾度もこの抗体を使ってウエスタンをしましたが、70kDにバンドは出ることはでますが、同じ強さのものがそれ以外に別の分子量で2本、合計3本でます。 なのでアミノ酸配列がヒト、マウスで100％一致していても、CSTがヒトへの反応性しか保証していないのであれば、マウスへの適用はやめておくべきでしょうか？￥

(無題) 削除/引用 No.7917-4 - 2019/05/27 (月) 08:25:23 - TM T細胞以外の細胞でその抗体を使ってますが、綺麗にバンドが出ますので、リン酸化Sykを認識していると考えています。

(無題) 削除/引用 No.7917-3 - 2019/05/25 (土) 13:18:40 - Zach おおさんありがとね！

(無題) 削除/引用 No.7917-2 - 2019/05/25 (土) 11:18:28 - おお メーカーに問い合わせるのが筋ではありませんか？あと、その抗体を作るための抗原など確認しましたか？

ZAP70抗体はSykを認識するか否か 削除/引用 No.7917-1 - 2019/05/25 (土) 10:55:13 - Zach 一つお尋ねさせてください。 今、あるマウス細胞においてSykのリン酸化を検討したいです。 そこでCST社の抗体リストを見てみますと、 ”Phospho-Zap-70 (Tyr319)/Syk (Tyr352) Antibody #2701” という抗体がありました。 これはZap70とSykは兄弟分子なので、いずれも認識します、という理解でいいでしょうか？ リファレンス論文はいずれもT細胞のシグナリングを見ておりZap70のリン酸化のプローブとして使われています。 これは果たして文字通りSykのチロシン352のリン酸化を認識しますでしょうか？ すみませんが教えてください。

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