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(無題) 削除/引用 No.7912-6 - 2019/05/24 (金) 14:04:10 - ZOO おおさん いろいろとtipsを教えていただきありがとうございます。 現在のプロトコールでは有機溶媒やグアニジンは用いていませんが、今後用いる際には気をつけたいと思います。 70%エタノールは多めに入れたほうが良いのですね。チューブの壁面などに残ったイソプロ沈殿後のキャリーオーバーもちゃんと洗える様に、せめて700-800ulは入れたほうがいいかなあと漠然と思ってはいたのですが、エタノールは消耗品だと思ってあまりケチらないようにします。 かなり量が限られた検体ではギリギリのDNA収量になったりする場合があり、最初からきれいに精製するストラテジーで進めていました。試料が十分あるサンプルについては、仰る様に検体からの直接PCRがいけるのであれば労力の削減につながるかもしれません。予備実験をやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.7912-5 - 2019/05/24 (金) 05:38:15 - おお >100ul程度のイソプロの残量なら問題ないのであれば、 上流の作業でフェノールなどの有機溶媒を使っていたり、グアニジンなどの変性剤（使うときは４M以上の結構高濃度でつかう）を使っているならなるべく抜いたほうがいいです。実験によっては生体材料からあまりステップをふまずエタ沈ということもあるでしょうけどそういうときは蛋白の混入なども多くなるかもしれません。 アルコールはNaClなどの溶解度が低いのでNaClを使ってエタ沈したときなどは塩の析出などは気になります。酢酸ナトリウムなどを使うと塩の析出は抑えられると思います。 精製したDNAを酵素処理したりPCR産物ならさほど残っていることに問題は感じません。 >検体が多くなるとエタノールの消費も早いので、できれば70%エタノールの添加量も減らしたいと思っています。 エタノール（７０％）は私はなるめく多めに入れます。消費はするでしょうけどストックの器をでっかくしたり（極端な場合はポリタンクから蛇口から取るとか）、して工夫してもいいんじゃないでしょうか。 検体から直接PCRして、必要なものを丁寧に精製するというスキームは取れないんでしょうか。 まあPCRなら阻害するようなものでなければかなりクルードでもできる場合は多いので、Quick and dirtyでやって次世代シーケンサーに行くときにもう１段階精製をかましてもいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7912-4 - 2019/05/23 (木) 17:28:57 - ZOO APさん ありがとうございます。100ulはちょっと言い過ぎでした。。すみません。雑なデカント後でも普通はそんなにはないと思います。 私に割り当てられたベンチの周辺には残念ながら良い感じのアスピレーターがないこともあり、あまりアスピレーターを使うことは考えていませんでした。 チューブの口をペーパータオルに叩くのは良いですね。これをするだけで大分マシ（というか十分？）になる気がします。 また、少々のイソプロの残存があってもほどほどの70%エタノールでwashすれば問題なさそうだという感覚も教えていただき安心しました。 丁寧にやるところと手を抜くところをうまく気をつけて、効率的に作業していきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.7912-3 - 2019/05/23 (木) 17:01:04 - AP >・デカントしたあとチューブを逆さにしたままペーパータオルの上に伏せて暫く置く。 チューブの口をペーパータオルに軽く叩きつけるのもいいです。 96ウェルでエタノール沈殿するときなんか、ペーパータオルにパンッと打ちつけたり、ひっくり返して軽く遠心したりして上清を除きますよ。

(無題) 削除/引用 No.7912-2 - 2019/05/23 (木) 15:50:52 - AP IPAの残渣が問題と言うよりそれに溶け込んだ不純物（塩など）がそのまま残るのがいかんのです。それさえなければリンスもなしにIPAの残滓をそのまま乾燥させてもいいくらい（ただしEtOHより揮発しにくいが）。 それにしても100 uLも残滓があるとは信じがたい。 やり方はいろいおｒあります。 ・面倒がらずにアスピレーターを使う（そいう発想はそもそもなかったのか？）。真空掃除機の要領で僅かな残滓も吸い取ります。デカントのあと再遠心、ピペットアウトなんてばかばかしい手間をかけるよりよっぽど良い。 ・デカントしたあとチューブを逆さにしたままペーパータオルの上に伏せて暫く置く。壁に残った残滓が吸い取られます。デカントのあとすぐに正立すると壁についた上清が底に戻ってしまいます。 ・70% EtOH　リンスを二回にする。 まあ、上清が100 uL残っていいようと400とか500 uLくらいの70% EtOHで一回リンスしたら大抵の実験では問題にならないくらいにはなると思います。 しかし、アルコール沈殿の上清除去の工程がまずデカントありき、みたいな様子にちょっと違和感がありました。

イソプロ沈殿について 削除/引用 No.7912-1 - 2019/05/23 (木) 15:30:43 - ZOO 現在、多検体のイソプロ沈殿、DNA抽出をただひたすら毎日行っています。 イソプロ沈殿を行うことはこれまでも非定期的にありましたが、現在それなりに検体数が多く、できるだけ作業を簡略化したいと思っています。 質問は、イソプロパノールの除去、70%エタノールでのwashはどれぐらいの丁寧さが必要か、ということです。 今までは、遠心後のイソプロ除去は単にデカントでイソプロを捨てただけではそこそこ（50-100ulぐらい？）液量が残っていることも多く、わざわざもう一回イソプロパノールを卓上遠心・ピペッティングで除去してできるだけイソプロを除去（残量＜10ul程度）して、その後70%エタノールを1mlエッペンドルフチューブに追加してwashしていました。 100ul程度のイソプロの残量なら問題ないのであれば、この辺りを簡略化したいと思うのですが、イソプロの残量はどれぐらい気にしないといけないものなのでしょうか？　（極端な話、イソプロがかなり残っていても再度のドライアップでうまく乾かせるのなら全く問題ないといって良いのでしょうか？） イソプロの残量の何倍程度70%エタノールを添加すれば十分、みたいな目安のようなものがあればお教えいただければ幸いです。 （検体が多くなるとエタノールの消費も早いので、できれば70%エタノールの添加量も減らしたいと思っています。） DNA抽出後は、PCRなどでいろいろとスクリーニングをかけて絞り込んだサンプルを次世代シーケンサー解析する予定です。適当に抽出して後で影響が出ても怖いと思って、皆様のご意見を伺いたく質問させていただきました。 よろしくお願いします。

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