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(無題) 削除/引用 No.7906-10 - 2019/05/22 (水) 04:45:31 - おお たしかどっかのPre-madeのサンプルバッファーは還元剤抜きで売っていて、ついでに色素にPoceauを使っていたりしてますが、ボイルしてから還元剤（多分DTT)入れるようになってませんでしたっけ。Poceauと還元剤入れてボイルするとPoceauは黒く変色するようで、それもあるのでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.7906-9 - 2019/05/22 (水) 00:14:52 - えsxdcfrgvhbjんkml「 再度ボイルはしていません。加熱する理由は いろいろあるのだとおもいますが、私がむかし本で読んだところでは、SDSが蛋白質にくっついて完全変性させるまでに室温だとあるいていど時間がかかるので、その時間を短縮させるために熱を加えるとかいてありました。なので、いったんSDSで変性させてしまえば、SDSを除去しないかぎり（そもそもこれ自体が結構難しい）、もとにもどらないとおもうので、再ボイルをする意義はないようにおもいます。あと一部のS-S bond加熱しないと切断されにくいものがあります。 ただ還元については、還元剤が酸化とかでへたってくると、再酸化がおこります。実際、SDS-sampleを凍結融解くりかえしてなんどもつかっていると、泳動パタンがだんだんブロードになってきたことあります。それに還元剤を追加したらもとに戻ったので還元剤の作用が低下してきたためとおもいました。通常のSDS-PAGEでは還元後、アルキル化しないのでSH基とS-Sの間は可逆的ですから、還元能が減弱してくれば再度酸化されます。サンプルはSDS-sample bufferに可溶化し、かつ還元剤なしで保存しておき、必要な時に必要量を分取して、泳動まえに還元処理するのがよいとおもいます。 DTTは強力で作用も早いが不安定で長持ちしない、betaMEはDTTより温和で作用も緩慢だが（なので加熱してその反応を促進するひつようがある）、安定で長持ちするとならいました。

(無題) 削除/引用 No.7906-8 - 2019/05/21 (火) 16:37:16 - カートン箱 確かに「DTTがボイル禁忌」は言い過ぎ、というか勘違いでしたね。 学生の頃に教員から「DTTは熱に弱いのでボイルでのSDS化には向かない」と聞いていたのでSDS化のメソッドによって使い分けていたのですが、それ以外のエビデンスはあやふやなままでした。 文献なり実験書なりできっちり再確認しておかないと。反省。

(無題) 削除/引用 No.7906-7 - 2019/05/21 (火) 15:01:18 - AP 別に禁忌というほどでも無いと思うけど。 実験書で普通に2-MEを代替できる風にしか書いてないのしか見たことがない。 ただDTTは還元力（還元電位っていうんですか？）が2-MEより強い一方、より容易に酸価されてヘタるというのは使い勝手としてある。

(無題) 削除/引用 No.7906-6 - 2019/05/21 (火) 13:32:57 - おお まあ失活しやすいだけの話で、ボイルしてもS-Sを切るのに十分量残っていれば大丈夫ですけどね。

(無題) 削除/引用 No.7906-5 - 2019/05/21 (火) 12:39:47 - あ DTTがボイル禁忌とは知らなんだ・

(無題) 削除/引用 No.7906-4 - 2019/05/21 (火) 11:33:25 - おお 私はボイルというより温めます。４０度以上あればいいかなっていう程度。SDSは低温で沈殿する傾向にあるので。

(無題) 削除/引用 No.7906-3 - 2019/05/21 (火) 11:05:55 - AP ものによるというのが正しいところでしょう。 そして未知のタンパク質、多様なタンパク質の混合物であるサンプルはボイルするのが安心でしょう。あたしは再ボイルします。市販のプレミックスマーカーなんかは凍結保存、ボイル不要になっていますけれど、同列にはできませんね。 再現性の問題もあって、凍結再融解というコントロールが効かない過程を経ても、いつでもどこでも再現性の良い結果が得られるかも不安があります。 あたしだったら、ボイル有り無しを並べて泳動して、ゲル染色パターン、イムノブロットのパターンに差異がないということをまず確認してからにします。

(無題) 削除/引用 No.7906-2 - 2019/05/21 (火) 08:58:47 - カートン箱 ボイル様 SDS条件変更の可否は、扱われているタンパク質の種類によるかと思います。 SDS-PAGEではペプチド鎖長に比例した泳動度を得るためにタンパク質を一本鎖へと変性させ、SDSをその一本鎖にまとわりつかせておく必要があります。 その主役は還元剤（2-ME、DTTなど）による分子内ジスルフィド結合の切断ですが、常温でタンパクに作用させると十分な変性効果を得るのに一般的には1時間程度かかります。構造が強固なタンパク質の場合、常温では変性できなかったり、時間を置くとリフォールディングしてくる場合もあります。 ボイル（熱変性）して高次構造をあるていど破壊しておくことで、還元剤の効果を向上させることができます（なおDTTは熱に弱いためボイルは禁忌）。 つまり、SDS-PAGEサンプル調製時の変性操作で使う変性剤やボイルの時間、温度、タイミングは、使うタンパクによって必須にも不要にもなります。 例えば、私が以前扱っていたタンパクの場合、2-ME&ボイルで変性させても、凍結・融解している間にリフォールディングしてダイマーを形成するような難物だったため、サンプルは用事調製するか、保管していたものは用時に再度2-MEを少量添加してボイルするのが鉄則でした。 逆に、ボイルすると凝集してしまうようなタンパクの場合は、DTT&常温で穏やかに変性させます。 2-MEは揮発性が高いので、保管中に還元剤濃度が低下して、タンパク質の高次構造が部分的に復活してしまうこともあり得ますね。 長々と書きましたが結論としては、PIの言うことを鵜呑みにする必要はないが、扱っているタンパク質のSDS化条件が既に定まっているのならばむやみに変更しない方が良いでしょう。

SDS-PAGEするときのボイルの必要性 削除/引用 No.7906-1 - 2019/05/21 (火) 08:16:21 - ボイル SDS-PAGEするときのボイルの必要性についてお伺いします。 サンプルを前日に調整し、ボイルしたのちRTで熱を冷まして凍結したものを翌日に流す場合、RTで解凍（１５３０分放置）したサンプルを再度ボイルする必要はあるのでしょうか？ 私自身、サンプルを調整した時に一旦ボイルすればそれでタンパクが完全に変性するので以降は必須の操作ではない気がしてます。 特にこれまで問題になったこともないのですが、ある時データ発表でPIが学生に泳動直前にボイルしないとダメだと言っていたので質問しました。

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