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(無題) 削除/引用 No.7905-5 - 2019/05/21 (火) 06:14:41 - kent 個人的にはFcがあってもそれほど気にしませんが、この手のベクターではFcの直後にサイトがないですか？ なくてもおおさんがいわれるようにPCRでin-fusionなどでのぞけます。 ちなみにFc融合たんぱく質として発現させたほうが一般的には断然分泌はいいです。 pcDNAとの違いですが、プロモータは一緒ですか？ シグナル配列も同じにしたのですか？ >[Re:1] Cloningさんは書きました : > invivogenから購入したhIgG Fc融合タンパク質用のプラスミドがあります。 > > このMCSサイト近傍の配列は以下の通りです。 > > IL2シグナル配列 - MCS - hIgGドメイン - SV40pAn > > このプラスミドを用いてCOS7にて融合タンパク質を発現させていますが、pcDNA3.1のそれに比べて圧倒的に発現が良いです。 > > そこで、今回Fcではないのですが、His-mycタグをC末に付けたものを同様の系で発現させたいです。 > そこでこのプラスミドを用いることが出来ないかご相談したいです。 > > つまり、 > IL2シグナル配列 - MCS - hIgGドメイン - SV40pAnに、 > > IL2シグナル配列 - ある遺伝子-His-mycタグ - hIgGドメイン - SV40pAn > > というものをクローニング（mycタグの最後にストップコドンを付けます）すれば、もしかしたらかなり発現の良い結果を期待できるのでは...と考えています。 > > 質問は、Fcドメインを切り出すことなく、Fcの前にストップコドンを置いても、高い高発現プラスミドとして期待できるでしょうか？ > > > > > > >

(無題) 削除/引用 No.7905-4 - 2019/05/21 (火) 03:32:59 - おお >おお様は、SV40pAnに関しては懸念は抱きませんでしょうか？ やってみないと結論が出ない部分もあるかもしれませんが私は hIgGドメインがmRNA上にあっても（翻訳されないが）、気にしません。 もちろん理想的にはhIgGドメインを除いてしまうことでしょう。ベクターのSV40pAnから下流の配列をMCSまでPCRしてインサートを入れるとそういうコンストラクトはできますけど。ただしうまく行っているベクターって思わぬところの配列がうまく行く要因になってたりもするので。たとえばよく発現するベクターの薬剤耐性を変更するためにプロモーターからPolyAまでを違う薬剤耐性がはいったプラスミドに移したけどあまり発現しなかったりとか。よくよくしらべると、プロモーターの上流のベクターの骨格部分がうまく作用してたとか。 まあ悩ましいところではありますがそういう事もあって個人的にはうまく行っているベクターはあまりいじらないという方向でまずはやるかなと。

(無題) 削除/引用 No.7905-3 - 2019/05/21 (火) 03:06:59 - Cloning おお様、有難うございます。 はい、invivogenから高いプラスミドを購入する前に、pcDNA3.1+にFc融合タンパク質をクローニングし、293TやCOS7でタンパク質発現を行わせてみましたが、SV40oriのコンビネーションがあるにも関わらず非常に発現量は低かったです。そういう理由があり、innvivogenからプラスミドを購入しました。 結果、理由はわからないのですが、圧倒的な発現量が認められましたので、このivivogenのベクターバックボーンに何か秘密があるのでは...と思いましてこのトピックを立てました。 すみません、はい。IL2シグナル配列を使いたいです。 IL2シグナル配列-興味ある遺伝子の細胞外ドメイン-His-mycをFcドメインの前にクローニングしたいです。Fcドメインの前に（mycの後ろに）ストップコドンを置きます。 おお様は、SV40pAnに関しては懸念は抱きませんでしょうか？ つまり、Fcドメインの前に、”IL2シグナル配列-興味ある遺伝子の細胞外ドメイン-His-myc-SV40pAn”をクローニングするべきなのかでも悩んでいます。 いかがでしょうか？ アドバイス大変参考になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7905-2 - 2019/05/21 (火) 02:53:16 - おお 膜タンパクや分泌されるタンパク質は一般に発現が強いとされる系でもかえってうまく発現されないことが多いようです。pcDNA3.1はSV40oriが確かあったと思うのでCosなどの系では一過性にプラスミドの複製がおきて相当量の発現が期待できますが、分泌系のタンパク質などでSV40oriがないベクターのほうがよく発現したという事例もここなどで聞いたことがあります。 また単純に比較が難しいのはpcDNA3.1を使った場合コザックをどの程度意識したのかもコンストラクションの出来に左右されます。 ＞そこでこのプラスミドを用いることが出来ないかご相談したいです。 といいますが、IL2シグナル配列がついていい蛋白を発現したいのかなど情報がありませんので、Yes、Noで答えるには無理があります。あなたが分泌するタンパク質を発現させようとしていて、N末のシグナルペプチドをIL2シグナル配列に置き換えるのであれば、うまく行く可能性はあります。ただしあなたの蛋白固有の性質（細胞に与える影響、毒性とか）のため発現しにくいこともありえます。C末はストップコドンを置いてhIgGドメインが翻訳されないようにするのも通用すると思います。 わたしはシグナル配列などをスワップしたとき起こりうる問題などはあまり詳しくはありませんのでその手の話は他の経験のある方のコメントが付けばと思っています。

Cloningのデザインについて教えてください 削除/引用 No.7905-1 - 2019/05/21 (火) 01:32:42 - Cloning invivogenから購入したhIgG Fc融合タンパク質用のプラスミドがあります。 このMCSサイト近傍の配列は以下の通りです。 IL2シグナル配列 - MCS - hIgGドメイン - SV40pAn このプラスミドを用いてCOS7にて融合タンパク質を発現させていますが、pcDNA3.1のそれに比べて圧倒的に発現が良いです。 そこで、今回Fcではないのですが、His-mycタグをC末に付けたものを同様の系で発現させたいです。 そこでこのプラスミドを用いることが出来ないかご相談したいです。 つまり、 IL2シグナル配列 - MCS - hIgGドメイン - SV40pAnに、 IL2シグナル配列 - ある遺伝子-His-mycタグ - hIgGドメイン - SV40pAn というものをクローニング（mycタグの最後にストップコドンを付けます）すれば、もしかしたらかなり発現の良い結果を期待できるのでは...と考えています。 質問は、Fcドメインを切り出すことなく、Fcの前にストップコドンを置いても、高い高発現プラスミドとして期待できるでしょうか？

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