Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

ベクター 発現と比較に関しまして トピック削除
No.7899-TOPIC - 2019/05/18 (土) 09:27:50 - 修行中
今現在あるタンパクの野生型と変異型を発現させ、その結果チロシンリン酸化に変化が出るかという実験を行なっております。
安定発現株を構築し比較を行いますが、他の論文を参照すると安定発現株を構築した場合でもMockをコントロールとして入れています。
この際、@野生型安定発現株、A変異型安定発現株、B元の細胞株＋Mockトランスフェクション、で比較する事になると思われますが、@Aの安定発現株に関してはトランスフェクションの作業を行う必要性はないでしょうか。
トランスフェクションの作業によって起きる変化が気になり伺いました。
比較を行うにあたって正しい比較方法を知りたいです。よろしくお願い申し上げます。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.7899-7 - 2019/05/21 (火) 13:45:55 - おお
>G418でセレクションして、残ったクローンであればどれを選択しても構わないと考えてよろしいでしょうか。

野生型安定発現株、変異型安定発現株がどのように取られたのですか。シングルクローンでなくセレクションしたあとコロニーを選択せずそのまま増やした（プール）なら同様にするべきとおもいます。

シングルクローンを拾うなら、まず形態的にオリジナルに近いものを複数拾い、複数で実験して親株から逸脱したクローンを拾っていないか注意する必要があります。ただ今回はIPなどのコントロールなのであまり気にしなくてもいいのかもしれません。IPで使うのならまあコントロールだけプールの状態で使ってもそんなに支障はないでしょう。

ありがとうございます 削除/引用
No.7899-6 - 2019/05/21 (火) 11:50:23 - 修行中
G418でセレクションして、残ったクローンであればどれを選択しても構わないと考えてよろしいでしょうか。
度々すみません。

(無題) 削除/引用
No.7899-5 - 2019/05/21 (火) 03:00:27 - おお
元の細胞株にあなたの発現したい蛋白のcDNAが入っていないFLAGのベクターをトランスフェクションして、G418耐性株を他の安定導入株と同様の方法で増やしてください。

まあこのコントロールは実験のデザイン次第では必要がないかもしれませんが保証はしません。

ありがとうございます 削除/引用
No.7899-4 - 2019/05/20 (月) 20:33:26 - 修行中
わかりやすいご説明ありがとうございます。
恥ずかしながMockの安定発現を取得する方法はG418耐性株をチョイスすればMock安定発現と言えるのでしょうか。
ちなみに@AはFLAGの癒合タンパクを発現するのでそれで確認しています。

(無題) 削除/引用
No.7899-3 - 2019/05/18 (土) 10:50:14 - mom
論文が見つからないのですが、G418耐性株は脂質組成が変化していたという報告を読んだことがあります。
すべての親細胞株でそうなるとは断言できませんし他の薬剤ならどうなのという疑問もありますが、空ベクター安定導入株もネガコンとして有った方が良いでしょう。
またクローン化するなら3株以上はデータを取って再現性を確認してください。
バルク（安定導入株50株程度以上の混合細胞：クローン化しないだけ）でアッセイするのも手ですね。ただし、培養を続けると細胞集団の性質が変わり易いので注意してください。最近は安定導入株の作製にはレンチウィルスベクターが手軽なので主流ですね。

(無題) 削除/引用
No.7899-2 - 2019/05/18 (土) 10:16:57 - み
Bも空ベクターを安定導入した状態にすれば良いでしょう。っというか普通はそうすると思います。薬剤耐性で安定発現細胞株を樹立する場合、薬剤処理の影響を除外したいから。

ベクター 発現と比較に関しまして 削除/引用
No.7899-1 - 2019/05/18 (土) 09:27:50 - 修行中
今現在あるタンパクの野生型と変異型を発現させ、その結果チロシンリン酸化に変化が出るかという実験を行なっております。
安定発現株を構築し比較を行いますが、他の論文を参照すると安定発現株を構築した場合でもMockをコントロールとして入れています。
この際、@野生型安定発現株、A変異型安定発現株、B元の細胞株＋Mockトランスフェクション、で比較する事になると思われますが、@Aの安定発現株に関してはトランスフェクションの作業を行う必要性はないでしょうか。
トランスフェクションの作業によって起きる変化が気になり伺いました。
比較を行うにあたって正しい比較方法を知りたいです。よろしくお願い申し上げます。
全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。