カートン箱さん、ありがとうございます。
> １．精製したタンパクが目的物でない
> →コンストラクトの構造、バキュロ非導入細胞（ネガコン）でのバンドはどうでしょうか
この可能性は最も考えたくないものですが、正直これが正しいかもしれません...
バキュロ非感染細胞ではそのバンドは検出されていません。
感染後3，４日目で培養上清中に認められるので、それだろうと確信を持っていました。
> ２．Hisタグ認識されたバンドが偽陽性だった
> →His残基が多いか集中しているタンパクだとあり得る
そうですね...否定はできないとは思います。
> ３．P1取得以降の実験では抗体or抗体希釈液が変性していた
抗ヒス抗体は後輩がルーチンに多目的で使用しているので、問題ないと思います。
> ４．P2,P3では産物が多すぎて精製後変性し、タグが3次構造or凝集体の中に埋まってしまって検出されない
> →強固な構造を持つタンパクでSDS-PAGE時に還元が不十分だとなおさら
分子量自体は90ｋDaほどです。
ただ横着して6ｘSDSサンプルバッファーは2MEを入れた状態のストック溶液をずっと使っていました。
本来であれば2MEは使用直前に入れるかと思いますが、完全に横着です。
なので...そうですね。もう一度6ｘのサンプルバッファーを使って行ってみます。
> ５．エピトープ付近に修飾サイト（糖鎖、リン酸化etc.）があり、抗体の接近が立体障害で妨害されている
> →CSTとHisタグの両方で検出されないので可能性は低そうですが
そうですね...可能性としては低そうです。
> ６．（保管方法にもよるが）P1サンプルでプロテアーゼによりタグ付近が切断され消失している
プロテアーゼ切断でタグがなくなっている可能性もなくもないとは思いますが、CSTの抗体でも染まらないのでその可能性は低いと考えています。
> ７．（同じく保管方法によるが）保管中に変性して不溶性になっている
> →単なるSDS-PAGEでのバンドはどうでしょうか
単なるSDSーPAGE後のCBB染色では、40ｋDaにバンドがシングルバンドとして検出されています。
> ぱっと思いつくのはこのあたりです。
> 個人的には４、７の複合要因のように思います。
ありがとうございます！
一度SDSサンプルバッファーをフレッシュなものにして、もう一度行ってみます！
今、コントロールで別のタグ（Fcタグ）のバキュロウイルスでも試しているところです。
それだと二量体を形成するため130ｋDaほどになるかと思います。
ただ、カートン箱さんの可能性の中では正直、1の可能性を認めたくはありませんが、その可能性が最も高いかもしれません...えらいこっちゃです... |
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