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(無題) 削除/引用 No.787-7 - 2012/08/02 (木) 15:53:31 - らしでむ 皆様、アドバイスありがとうございました。 EtBrが陰極側に泳動されることは知りませんでした。 PCR産物の泳動をすこし短めにして、ゲルの下半分を少し厚めとなるようにしてみたら、バンドの濃さが上下のゲルで変わらないきれいなバンドを得る事ができました。

(無題) 削除/引用 No.787-6 - 2012/07/26 (木) 13:33:38 - AP 昔から両論ある、でも行き着くところは好みの問題なんですけれど。。。 一応、後染めのメリットを言っておくと、 染色に時間や手間がかかるといっても、よほど濃度の濃いゲルでなければ、バンドを確認するだけなら10分程度、定量的に染色飽和するまで20-30分位、EtBr希釈液の中に放置しておくだけなんですけれどね。振盪やdestainingはいりません。一分、一秒を争うような実験スケジュールで動いている人には、それでも惜しいかもしれませんが。 ゲル作製から電気泳動まで、EtBr freeなので素手でも作業ができます。 染色液は長期間使い回しができます。切り出しやブロッティングのときは新しい染色液を使い、これを通常のの染色用にお下がりしています。EtBrの曝露を最小限にできます。 バンドのサイズだけでなく、濃さも重要な情報で、一枚のゲルの中でEtBr濃度が低かったり高かったりするのは、その情報をダメにします。 バンドが見た目で予想されるより濃かったりすれば、それはバンドが複数重なっているんだろうとかわかりますし、定量をバンドの濃さの比色することもあります。 ポストゲノム時代から仕事を始めた人と、私のように、興味の遺伝子は自らクローニングし構造や塩基配列を決定して行かなければならなかった時代にトレーニングを受けた人間とで思想が違うのかもしれませんが、、、 今では、ほとんどの人が、既知の遺伝子配列をもとに仕事をしていてどんなバンドが出るかわかった上で電気泳動をすることがほとんどでしょう。でも、未知の配列、たとえば初めて単離したクローンを扱うとしたら、小さなバンドでも見落としては問題だし、二本重なっているバンドを見抜けなければ大失態です。私みたいのは、そういうことが身に染み付いているんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.787-5 - 2012/07/26 (木) 08:57:55 - ばんやり 昔の話ですが、長時間の泳動時にはペリスタポンプで陰極側のバッファーを陽極側に送っていました。 エチジウム入りのゲルを使うと陰極側のバッファにエチジウムがたまります。それを陽極側に入れて循環させるとともに、イオンの偏りをある程度戻しバッファを安定させる目的もあります。PCR産物だと、論文のFigにするようなものでない限り使わないとは思いますが。 後染めだとEtBrの濃度を、変異原性が出る濃度以下にすることができます。バイトが実験しているときは、ずっと後染めでした。今のラボではゲルに入れる方式なので、ゲルと陽極側にエチジウムを入れています。

(無題) 削除/引用 No.787-4 - 2012/07/25 (水) 19:37:08 - カイ 後染めの方がムラなくできるというのは百も承知なのですが、時間かかるじゃないですか。（面倒くさがりですみません) だから私はゲルの半分までしか流さない。ちゃんと長く流して分離したい時はゲルの長さを２倍にする。そうすればDNAのあるところはEtBrがちゃんと残ってます。…という手抜き法で済ませてます。 学生実験の時は後染め法でしていました。学生さんにEtBrを触らせない、というのと、ムラ防止ですね。

(無題) 削除/引用 No.787-3 - 2012/07/25 (水) 11:35:24 - AP EtBr入のゲルだとそうなりますよね。 泳動バッファーの方にもEtBrを入れておくと防げますが、汚染リスクが高まります。 染色ムラも、むだにいろいろ汚染するのもいやなので、私は徹底して後染め派

(無題) 削除/引用 No.787-2 - 2012/07/25 (水) 11:24:57 - qq エチブロ入りのゲルでしょ？ エチブロは、電気泳動で、ウェルの方向に泳動されますよ。

アガロースゲル下流のバンドが薄くなる 削除/引用 No.787-1 - 2012/07/25 (水) 11:19:44 - らしでむ PCR産物をアガロースゲルに電気泳動してUV照射にてバンドを確認しているのですが、 アガロースゲル上段に流したPCR産物のバンドは濃く明瞭に見えるのですが、同じPCR産物であっても同じアガロースゲルの下半分を使って泳動したものでは、バンドが薄くぼやけて見えます。 ゲルを１８０度回してUVランプで観察してもバンドの濃さには変わりがないので、UVランプには問題はないと思います。 同僚のひとりはEtBrの染色ムラではないかと言うのですが、上半分はきちんと染まって、下半分のものはぼんやりと染まる、というのも不自然なような気がします。 どなたかゲルの下半分のバンドを明瞭に見えるための方法につきアドバイスをお願いします。

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