Bio Technical フォーラム

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レポーターアッセイ用プラスミド作製について. トピック削除
No.785-TOPIC - 2012/07/24 (火) 10:57:48 - わんこ
レポーターアッセイの実験を計画しております.
プラスミドは,ルシフェラーゼ(promega)のものを使う予定です.

初めて,レポーターアッセイを行うのですが,
挿入するプロモーター配列については,
論文などから,どうにか当たりを付けられました.
作製準備にかかり,下記,いくつか分からない点が出てきました.

1)プロモーターを挿入する場合,フレームシフトを気にする必要が無いのか?
フレームは特に関係無いのか?3種作製するのが普通なのか?

2)Nuclear localization signal(NLS)を付加しようと計画しておりますが,
コレと言う配列見当たりません.
論文から,RKRKR,PKKKRKVと言うアミノ酸配列が出てきましたが,
いくつもあり,何が違うのか?が分かりません.

以上,ご存知の方がいらっしゃいましたら,教えて頂けないでしょうか?
どうぞよろしくお願い致します.
 
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(無題) 削除/引用
No.785-20 - 2012/07/24 (火) 17:32:02 - 774
1. Lucを使ったレポーターアッセイという時点でライブでの観察を考えてませんでした。
2. co-transfectionで解決すると思ってました。
なので、初心者の方と思い込んであのスレッドの書き込みをしました。

実験スキームが理解できてない上に、こちらの勘違いで失礼しました。
私のせいでせっかくの機会を無駄にしたかもしれません。すみませんでした。

レポーターアッセイ用プラスミド作製について. 解決済み 削除/引用
No.785-18 - 2012/07/24 (火) 17:09:00 - わんこ
774 様

改めて,ご返信ありがとうございます.


>[Re:17] 774さんは書きました :
> そのような環境で新しい分野の研究を開始するのは非常に大変だと思います。
生物分野かた飛び出して,世界が広がったので,大変だとは思っておりません.
ただ,びっくりする事,言葉が通じない(捉え方が違う?)事,簡単にできると思われている事が多々あります.
部分によっては,幸い,トップクラスの研究者の方々に相談できております.

レポーターに関して,実験立ち上げのため,外部の先生方にオープンに出来ない部分が多々あり,対研究者となると相談できる方々は限られてしまいます.


> 果たして、私が提案した方法は本当に適切な方法でしょうか?
申し訳ございません.
co-transfection については,不適切であることは承知しております.
しかし,改めて分離して考えることを認識させられ,
様々な方法で再検討できることを再認識させられたことに感謝致しました.


> ライブで観察するのとレポーターアッセイはどのような関係になるでしょうか?
『promoter の活性が細胞周期で変化する.』
これに関する論文は多々あります.

私の表現が間違っているのですね.
レポーターを利用して,promoterの活性を見たいのです.
(これも間違っているのだろうか・・・)


> また、方法が正しいとしても、結果を正しく解釈することが可能でしょうか?

これは,先生方と議論を重ねるしかないでしょう.


> 知らないことが多い場合には、間違った時に間違いを指摘してもらえる環境が必要だと思います。

決して,私が研究結果を出す訳では無く,
先生方と一緒に議論を重ねて進めることですので,
まずは,論文の再現性(改良してますが)を取ってからだと思っております.

コメントありがとうございました.

しつこくすみません。 削除/引用
No.785-17 - 2012/07/24 (火) 16:44:43 - 774
そのような環境で新しい分野の研究を開始するのは非常に大変だと思います。
ただ、そのような環境だからこそしっかりと責任を持って指導してもらうべきだと考えます。

果たして、私が提案した方法は本当に適切な方法でしょうか?
ライブで観察するのとレポーターアッセイはどのような関係になるでしょうか?
また、方法が正しいとしても、結果を正しく解釈することが可能でしょうか?

知らないことが多い場合には、間違った時に間違いを指摘してもらえる環境が必要だと思います。
過去の人脈を辿って意見を聞ける関係にあるなら、その方にどなかた適切な方を紹介してもらって、きちんと指導(アドバイス)して頂くことが最善であると思います。

レポーターアッセイ用プラスミド作製について. 解決済み 削除/引用
No.785-16 - 2012/07/24 (火) 16:15:42 - わんこ
皆様

たくさんのコメントありがとうございました.

完全に解決していませんが,
見通しがついてきたため,トピックを閉めさせて頂きます.

皆様の研究生活の貴重なお時間を頂きありがとうございました.

レポーターアッセイ用プラスミド作製について. 削除/引用
No.785-15 - 2012/07/24 (火) 16:10:35 - わんこ
774 様

ご紹介ありがとうございます.

聞く人が近くに居ないのか?
技術員として職務に就いておりますが,
異分野に飛び込んでいるため,研究室内&近所には,自分以外に生物系の方がいらっしゃいません.
研究室の先生も,プラスミドすら良く知らない方々です.

『こんなことがやりたい』に対し,全力で調べ,プローブ,プロトコルを作製しております.

過去の自分の関係者を通しても伺っておりますが,
この件に関しては分からないとのことでした.

人によって捉え方は違うと思いますが,
このような環境で実験を行なっている私にとっては,
最後の頼み綱として,この掲示板を利用させて頂いております.
十分な知識が足りていないことは大変申し訳無く思っております.

このようなコメントを頂き,正直,残念でなりません.


>[Re:13] 774さんは書きました :
> 参考まで
>
> http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=627

(無題) 削除/引用
No.785-13 - 2012/07/24 (火) 15:50:46 - 774
参考まで

http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=627

書いている間にコメントが 削除/引用
No.785-11 - 2012/07/24 (火) 15:22:21 - ~
>5'側の蛋白質の一部に関しては,promoter領域を外さないために選んでおり,
>特に発現してくることは期待していません.

期待の有無はいいのですが、転写開始点はどこにあるのでしょうか。

これはどういうレポーターアッセイ? 削除/引用
No.785-10 - 2012/07/24 (火) 15:20:51 - ~
なぜルシフェラーゼタンパク質(+5'一部&3'一部?)が核内に局在する必要があるのかが分からないのですが。
このルシフェラーゼは、細胞を溶解した後にピッカジーン等で処理して発光させるために発現させているのではなく、核内で転写因子(のコントロール)として機能させるのでしょうか?

>こんな事に注意して,絞り込むと良い
融合タンパク質が核内に局在したことが示されているコンストラクトをもとにしてみてはいかがでしょうか。
ICCで局在を示している論文はありますよね。


また、他の方には通じているのかもしれませんが、
>-promoter-5'一部-NLS-luciferase-3'一部-
の”一部”と、
>target Prot.が他の遺伝子発現(転写)に影響を与えるため,
>発現したProt.が同様の効果を示す様,DNAに作用する配列を付加
の”発現したProt.”と”DNAに作用する配列”
が何を示しているのか分かりません。

”一部”:target prot.の一部であり、翻訳されてアミノ酸となる or ベクターのMCSの残り or 転写調節に影響するシスエレメント

”発現したProt.”:レポータープラスミドとco transfectionによって導入するexogenous なtarget prot. or ルシフェラーゼ融合タンパク質

”DNAに作用する配列”:翻訳されてDNAと結合するアミノ酸をコードするDNA配列 or レポータープラスミド側のシスエレメント

文脈からどちらか一方ではないかと考えられる部分もありますが、違う場合はコメントが変わるかと思います。

(無題) 削除/引用
No.785-9 - 2012/07/24 (火) 15:16:34 - 774
標的タンパクの発現ベクター(全長、N末、C末)とそのプロモーターを組み込んだレポーターとのco-transfectionの方が一般的な気がしますが、どうでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.785-6 - 2012/07/24 (火) 14:41:13 - 774
> 作用するためには核内移動する必要があるためNLSを付加

何が核内に移動する必要があるとお考えでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.785-4 - 2012/07/24 (火) 13:16:37 - ~
>いくつもあり,何が違うのか?
由来する遺伝子または報告。

NLS-luciferase融合タンパク質が使われている報告はありますよね。
それを元にしようとしないのは、特殊な用途に用いる予定だからでしょうか?
そうであれば、その用途が達成される条件を明確にし、文献情報なり予備実験で確認してはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.785-3 - 2012/07/24 (火) 12:29:34 - TS
> 1)プロモーターを挿入する場合,フレームシフトを気にする必要が無いのか?
> フレームは特に関係無いのか?3種作製するのが普通なのか?

発現するタンパク質は、ルシフェラーゼなので、プロモータ領域にフレームとかの概念はないでしょう。


>
> 2)Nuclear localization signal(NLS)を付加しようと計画しておりますが,

ルシフェラーゼにつけるのですか?
発現するものを再度確認してみては。たぶんいらないでしょう。

初めてということですし、ご自分でも勉強されているという印象を受けますので、そのプロモータプラスミドで何が起こるのか、何が発現するのかなど、もう少し整理してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.785-2 - 2012/07/24 (火) 12:16:07 - TK-1
> 1)プロモーターを挿入する場合,フレームシフトを気にする必要が無いのか?
> フレームは特に関係無いのか?3種作製するのが普通なのか?
常識的に判断してください。

>
> 2)Nuclear localization signal(NLS)を付加しようと計画しておりますが,
この目的は何でしょうか。

レポーターアッセイ用プラスミド作製について. 削除/引用
No.785-1 - 2012/07/24 (火) 10:57:48 - わんこ
レポーターアッセイの実験を計画しております.
プラスミドは,ルシフェラーゼ(promega)のものを使う予定です.

初めて,レポーターアッセイを行うのですが,
挿入するプロモーター配列については,
論文などから,どうにか当たりを付けられました.
作製準備にかかり,下記,いくつか分からない点が出てきました.

1)プロモーターを挿入する場合,フレームシフトを気にする必要が無いのか?
フレームは特に関係無いのか?3種作製するのが普通なのか?

2)Nuclear localization signal(NLS)を付加しようと計画しておりますが,
コレと言う配列見当たりません.
論文から,RKRKR,PKKKRKVと言うアミノ酸配列が出てきましたが,
いくつもあり,何が違うのか?が分かりません.

以上,ご存知の方がいらっしゃいましたら,教えて頂けないでしょうか?
どうぞよろしくお願い致します.

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