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One stepリアルタイムＰＣＲ時の混合方法 トピック削除
No.784-TOPIC - 2012/07/24 (火) 10:55:01 - 転倒混和
いつもお世話になっております。

One-step real-time PCRでプライマーミックスと鋳型RNAを混合するとき、皆さんはどうされているでしょうか？私は普通のRT-PCRの時はキャップを閉めて転倒混和し、スピンダウンして使っていました。しかしキャップがreal-time PCR用でないため、ABI7500でのreal-time PCR時には転倒混和、スピンダウン後にキャップを外しABIの推奨するシールを貼っています。

ABIのシールは、圧着力が弱いため、転倒混和時にキャップをしているのですが、どうにも無駄なことをしているような気がして、転倒混和をせずにreal-time PCRを行いました。その検量線の結果を見る限り、濃度不均衡で問題が起きているように見えません。対流だけで混ざったという気もします。

PCR前にキャップを開けるのはコンタミの元にもなるので、このまま転倒混和を続けるなら、Real-time PCR用のキャップを購入しようと思います。

皆さんは鋳型とprimer-MIXの混合をどのようにされていますか？
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.784-4 - 2012/08/02 (木) 21:58:20 - KEN
低めのスタンダードがばらつくとのことですが、希釈は何でされていますか？水かTEだとバラつきが強くなることがあります。
tRNA等のキャリアーを入れるとばらつきが減ります。
私はズボラなのでTAKARAのEASY Dilution (for Real Time PCR)を使っています。

様々なご意見があるかと思いますが、私はあまり酵素が入った溶液をボルテックスするのは、おすすめしません。
昔、酵素はボルテックスすると失活するからやめろと習ったもので。
ただ、実際どこまで本当なのか。
活性を測ってまで試したことはありませんが、軽くなら経験上大丈夫です。
強くやるのはやめたほうが良いかと思います。。。

(無題) 解決済み 削除/引用
No.784-3 - 2012/08/01 (水) 19:00:04 - 転倒混和
KEN様

お教えいただきありがとうございました。

このトピックを投稿した後、シールをアプリケータでプレートに付けた状態で、ABI9700のホットボンネットで熱圧着しパルスボルテックスした後、スピンダウンして実験してみましたが、混合不良と思われる結果は見つかりませんでした。低めのコピー数のスタンダードが若干ばらつきますが、これは転倒混和の時にもでていた症状でした。

今度は、スピンダウンだけで行ってみようと思います。毎回検量線を引く方法のため、PCRがうまくいっているかどうかは判断しやすいと思います。

7500かキットのマニュアルか覚えていませんが、PCRプレートのウエルの底に泡があると検出時に問題が起きるので、反応開始前にスピンダウンはしっかり行ってくださいと指示があったような気がします。

KEN様、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.784-2 - 2012/07/31 (火) 17:22:42 - KEN
私は384wellもしくは96wellで7900HTを使って実験しております。
結論から申し上げますとRNAを入れてからの転倒混和はしていません。

シールは、Life Technologiesのものを以前は使っていましたが、さほど粘着力で困ったことになったことはありません。今は、キャンペーンで買った安いシールとプレートを用いています。（特にデータのぶれはありません。）
シールの粘着が悪いとのことですが、プレートを384wellのアルミブロックにセットした状態でキムタオルでゴシゴシ拭き圧着させています。

ただ、Realtime実施前にプレートを遠心機で軽くまわしてスピンダウンは必ず行うようにして下さい。
以前、スピンダウンさせずに行うとどうなるか試したことがありますが、ものすごくバラつきました。
よって、おっしゃられるように、スピンダウンさせた時点で、濃度不均衡はなくなっていると考えて良いのではないでしょうか。

逆に、蓋を外してシールをつけてなど行なっていると、コンタミのリスクが高くなる気がします。

One stepリアルタイムＰＣＲ時の混合方法 削除/引用
No.784-1 - 2012/07/24 (火) 10:55:01 - 転倒混和
いつもお世話になっております。

One-step real-time PCRでプライマーミックスと鋳型RNAを混合するとき、皆さんはどうされているでしょうか？私は普通のRT-PCRの時はキャップを閉めて転倒混和し、スピンダウンして使っていました。しかしキャップがreal-time PCR用でないため、ABI7500でのreal-time PCR時には転倒混和、スピンダウン後にキャップを外しABIの推奨するシールを貼っています。

ABIのシールは、圧着力が弱いため、転倒混和時にキャップをしているのですが、どうにも無駄なことをしているような気がして、転倒混和をせずにreal-time PCRを行いました。その検量線の結果を見る限り、濃度不均衡で問題が起きているように見えません。対流だけで混ざったという気もします。

PCR前にキャップを開けるのはコンタミの元にもなるので、このまま転倒混和を続けるなら、Real-time PCR用のキャップを購入しようと思います。

皆さんは鋳型とprimer-MIXの混合をどのようにされていますか？
よろしくお願いいたします。
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