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(無題) 削除/引用 No.7822-13 - 2019/04/17 (水) 11:24:03 - 困った人 また、以前の書き込みで記載ミスです。 IDなので皮内ですね。すみません。 SCでもいいのですが、どなたかが仰るように、腫瘍形成が分かりにくい事があるようですね。 ハプロタイプのことは把握していましたが、普通は増えるような系なので、今のところはそこまで深刻に考えていませんでした。もしも細胞数を増やそうとするなら、数を振って検討する必要がありそうですね。 SPFグレードの問題ですが、こちらのマウスはクリーンではないですね。 未処置のマウスですら、OVAやダニ抗原に対するT細胞の反応性が異様に高いとか、血中の好中球％が高いとか良く目にします。 それが原因でB16の増殖が悪いとまでは考えませんでしたが、自然抵抗性が上がっているということであれば無視できませんね。

sonogo 削除/引用 No.7822-12 - 2019/04/17 (水) 11:18:30 - 困った人 皆様ありがとうございます。 プロトコールを色々と調べなおしたり、ジャンクマウスで増殖を見たりしていました。 結論として、細胞のコンディションが悪いことが一番の原因かもしれません。 ラボのほかの人に聞いたところ、前任者が私に渡した細胞は、過去に他の人達がIDやIVで試しても増殖が極めて悪かったと言うことが分かりました。 その場合、P10くらいまで飼って、1/10 passageで2-3日で100％confluentになるようにしてから使っていたそうです。

(無題) 削除/引用 No.7822-11 - 2019/04/16 (火) 12:55:19 - nom 困った人さん なかなかそのような事情では失敗はしたくないですね.. 経験上B16-F10は増殖速度は早いと感じていましたので、 細胞の状態が原因である可能性もあるように感じます。 単に腫瘍の形成を見るのであれば、day14なら遅くともある程度の大きさになると思います。 打ち方ですが、おおさまの言うように皮内の時はけっこう抵抗があります。 ただ皮内では形成が遅いというような感じはありません。 腫瘍に痂皮ができやすいと思いますが。 余談ですが、うちのラボでは細胞投与の際はイソフルラン麻酔下で皮下投与をすることもあります。

(無題) 削除/引用 No.7822-10 - 2019/04/16 (火) 02:21:29 - おお クライオチューブにLNが入り込むのはたいてい起こることだと思います。避けようがないので気相で保存する事が推奨されています。 インド人という事が何ら関係しているようには思いませんけど、、、 疑う、疑わないに関わらずプロトコール、基本手技などはちゃんとした文献、成書などで自分で確認しておくべきではないですか？ 皮下は比較的すっと入りますが、皮内はかなり抵抗があります。皮下に入った針は少し左右に動かすと自由に動き皮膚とその下の組織の間に入っていることが感覚的にわかります。ただしやりすぎると皮下の広範囲に細胞けんだく液が広がる隙間を作ってしまいます。実験の前にテクニカルな確認でやればいいのかもしれません。 細胞はなんに懸濁して打ってますか？

(無題) 削除/引用 No.7822-9 - 2019/04/16 (火) 01:51:18 - さかな 下記箇条書きとなっていますがご容赦ください 100uLの皮下注だと盛り上がったようにはならないと思います。 皮内中になってしまうと、ドーム状に盛り上がります。 B6マウスにB16-F10を移植する場合は、5E5cells移植すれば十分です。 腫瘍形成のみ見るのであれば1E5cellsで十分です。 1E5cellsですと腫瘍径にばらつきがでるので、腫瘍径がそろいやすい5E5cellsがおすすめです bハプロタイプの腫瘍細胞株B16-F10を、同じBハプロタイプのB6に移植する場合、移植細胞数が多すぎると同ハプロタイプとはいえ拒絶され腫瘍が形成されにくくなります あまり環境の良くないSPFで飼育したB6に移植した場合、腫瘍形成までに7-10日程度かかったことがあります チャールズリバーから購入したB6にすぐに移植した場合、5日程度形成されていました また、B16-F10の状態が悪いとのことですが、10分の1継代で4〜5日だと増殖が遅いかと思います 100% confluencyの培養細胞を、10分の1継代で3日で100% confluencyになるまで培養をして、増殖の良い細胞を使用した方が良いかと思います B16-F10か疑わしい場合は、ATCCに写真があるのでそれと比較して形状が異なっていないか確認した方が良いかと ただのB16とも比較した方が良いと思います B16の場合は、1E6で移植しても腫瘍が形成されないことがあります

(無題) 削除/引用 No.7822-8 - 2019/04/15 (月) 17:05:38 - 困った人 ちなみに打ち方ですが、打った後に皮膚がドーム状に盛り上がるくらいの浅さで良いのでしょうか。針を抜く際にゆっくりと、それと針穴をピンセットで押さえて漏れが無いようにしています。 深すぎることは無いように気を遣っていましたが、反対に浅すぎるということはありますか？

(無題) 削除/引用 No.7822-7 - 2019/04/15 (月) 17:02:44 - 困った人 nomさん、 そんなに大規模に行えているんですね。羨ましいいです。 こちらのKOはラボ内で取り合いで、なかなか数が確保できないので、最高でも一度で５−５でしかできません。その上、このような状況で、大変困っています。実験スピードが相当スローです。アメリカなのですが、マウス維持費が高い地域の大学、研究機関ではケージコスト削減のためにマウス数を増やさず、こういうスローな感じになることが良くあり焦ります。１ヶ月のうちに同じ実験が２回しかで仕込めないという感じで時間だけが過ぎていきます。ですので、ミスはしたくないのが本音です。 今飼っているF10はATCCのものなのですが、保存状態が悪く（すべてのクライオチューブの蓋が緩んでいて、LNが内部に侵入していました）起こしてからの立ち上がりもスローでした。継代も通常３日くらいで行えるようですが、４−５日待たないとできません。 それも考慮して、新しい株を入手するか、長めに継代してコンディションの良いものを選んでいくか、打つ数を増やしてみるかします。 ちょっと様子をみて成長を報告します。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7822-6 - 2019/04/15 (月) 16:53:22 - 困った人 Trailerさん ありがとうございます。 細胞はトリパンブルー顕微鏡カウントでほぼ１００％生きていました。その後、数合わせをしてon iceでinjection までもって行っています。細胞を剥離してからは、時間にして30分くらいで全て済んでいます。 やはり数は少なめだったのでしょうか。となると、前任者（あえて言えばインド人、話が分かる人だけ納得いただければいいのですが(笑)）の論文に出ている、3日目で直径5-10mmmnの成長というのが極めて怪しくなります。。。 自分の経験上、ヌードマウスに不死化したT細部株を打った時は10の7乗でやっていました。その条件でも14-21日かかって直径10mm以上になるといった感じでした。 もちろんソースが違いますが、それから比べると、数は少ないなとは感じていましたが。 もしあまりにも成長が遅いようでしたら、次回は数を増やしてみます。いずれにせよday14で見たいので、遅かったとしても最終的に育ってくれればいいんですけど。。。 皆さんのおかげで実験系自体の心配は拭えました。いかんせん前任者（インド人、これについては話の分かる人のみ分かっていただければ良いかと(笑)）のストック細胞、プロトコールに従っていたので不安で仕方がありませんでした。 もう少し粘って成長を見守ります。

(無題) 削除/引用 No.7822-5 - 2019/04/15 (月) 16:47:41 - nom その個体数でしたらたまたま増殖の遅い個体である可能性もあります。 私のところでは50匹ほどに投与していますが、増殖速度はまちまちです。 trailerさまの言うように、氷冷下、カウントからの時間は最小限にしています。 経過報告お待ちしています。

(無題) 削除/引用 No.7822-4 - 2019/04/15 (月) 15:07:32 - trailer 私が植えた時は、細胞数5x10^6/100ul とかだったかなあ。 10^6だと育つの遅いかもしれない(ウチで持ってるF10株が遅いのかも？) あと、細胞をカウントしてから打つまでの時間がかかり過ぎで死んでいってるとか。 (打つ直前まで氷冷してやると少しは改善されます、というか氷冷は必須と言ってもよい)

(無題) 削除/引用 No.7822-3 - 2019/04/15 (月) 14:30:01 - 困った人 ありがとうございます。 WTとKOで3匹ずつです。 これまで皮膚免疫をやっていたので、IDやSCには慣れています。打ち込み自体は大丈夫だと思います。 打った後、皮膚がドーム状に盛り上がること、漏れがないことは確認しました。 とりあえずもう少し待ってみます。

(無題) 削除/引用 No.7822-2 - 2019/04/15 (月) 12:05:46 - nom 実際に行ったことがあります。 細胞数は同様の濃度で行いました。 確かに増殖の速い個体は3日ほどで腫瘍が形成されます。 しかし、投与の位置によっては、確認できないこともあります。 だいたい一週間もすればどの個体も腫瘍形成は確認できますが。 また、皮下に投与できている確証はありますか。 経験の浅い人が行ったときは皮下より下に打ってしまい確認しづらくなることがありますので。 また何匹に投与を行いましたか？

至急！B16-F10の皮下注射について 削除/引用 No.7822-1 - 2019/04/15 (月) 11:27:06 - 困った人 どなたか、B6WTマウスに対して、B16-F10メラノーマ細胞の皮下注射をしたことありますか？ DMEMで培養した細胞をトリプシンで剥がし、カウントして10^6を100ul PBSで打って、メラノーマが形成されません。現在5日目ですが、前任者は3日目に既にしこりが確認できたと言っていました。 大体何日くらいしたら、目に見えて分かる腫瘍になりますか？ それか、根本的に細胞数が少ないとか、何かおかしいのでしょうか。 大変困っています。どなたか助けてください。

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