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(無題) 削除/引用 No.7808-7 - 2019/04/07 (日) 10:15:51 - AP フェノール抽出までの前処理がどうなっているかわかりませんが(界面活性剤、EDTA、ProK処理なんかでしょうか)、フェノール処理の前に塩析のステップを入れて大部分のタンパク質を沈殿として除いておくといいです。 終濃度2.5 Mの酢酸アンモニウム(例えば7.5 Mを1/2 vol加える)、氷温でしばらく置いて遠心、上清を回収です。用途によってはこれにアルコールを加えて沈殿するだけでも十分なくらいですが、その前にフェノール抽出すれば上等、一手間かけるだけで断然楽にできます。 この方法は、原核、真核ゲノムDNAにもファージDNAにも適用できます。

(無題) 削除/引用 No.7808-5 - 2019/04/07 (日) 09:35:09 - moz 水層を取るときに粘性で中間層も巻き込みやすいから、タンパク含量が多いならProK-SDS処理でタンパクを前もって減らしておくのも手です。

(無題) 削除/引用 No.7808-4 - 2019/04/07 (日) 03:53:45 - BAC アドバイスありがとうございます。 転倒混和かシェイカーで気長に混和したいと思います。また、抽出もフェノール抽出から順に行なっていこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.7808-3 - 2019/04/04 (木) 17:36:09 - AP フェノールクロロフォルム抽出は必ずしも乳化するまで撹拌しなければならないものではありません。水層とフェノール層の界面でもタンパク質の不溶化は起こるので、ローテーターなどを用いて気長に転倒混和すればよろしい。 PCI (フェノール：クロロフォルム　1:1混合液）は水と相分離しやすいのが取り柄ですが、バッファ飽和フェノール単体のほうが水に馴染みやすく分、乳化しやすくまた多糖類などのPCIでは水層に行ってしまう不純物も除去されやすかったりします。昔は、フェノール→PCI→クロロフォルムのように段階的な抽出するのが主流でした。 で、このように激しく混和できないような場合は、まずフェノール抽出から始めるといいと思います。あるいは混和の段階ではフェノールのみ、相分離させる段階でクロロフォルムを加えるとか。

(無題) 削除/引用 No.7808-2 - 2019/04/04 (木) 13:13:17 - おお 水相と有機相が目で見て分離した状態でもいいから転倒混和、コニカルチューブなら横にしてシーソーのように振るシェイカーにセットすればいいです。大体１５分以上振っておけばいいでしょう。ゲノムの精製ではそういう風にする事がよくあります。

高分子DNA精製法 削除/引用 No.7808-1 - 2019/04/04 (木) 13:03:35 - BAC 150-200kbp高分子DNAをフェノクロ等を用いて、抽出、精製しようと思うのですが、液の混和方法について、お聞きしたいです。 一般的に、高分子DNAは、ボルテックス厳禁と言われております。しかし、転倒混和等では十分に溶液が混ざりません。高分子DNAを扱う際に、みなさんは、どのようにして液を混和させていますか？

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