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(無題) 削除/引用 No.7802-8 - 2019/04/03 (水) 01:02:44 - おお それぐらい長期であればインテグレートされていたほうがいいので、レンチを使うのがいいでしょうね。 レンチなどのウイルスベクターがポピュラーでない昔なら恒常的に発現するか、inducible なStable Cell lineを樹立するしてから実験するといった方法をとったことも結構あると思います。ま、もちろん今でも選択肢ではあると思います。

(無題) 削除/引用 No.7802-7 - 2019/04/02 (火) 21:38:33 - kks lipofectamine2000でHeLaにプラスミドを一過性で導入後、継代して増やしてからとある実験に使っていたことがあります。 継代後3-4日もすればウェスタンで目的タンパク質の発現がほとんど確認できない場合もあり、結局stableを作製するのに落ち着きました。。 皆様の言われている通り、継代を挟むと活発に分裂が行われる関係であっという間に希釈されてしまうようです。 気になるなら導入後、経時的に細胞ライセートを調製してウェスタンに供するだけでも確認ができると思います。

(無題) 削除/引用 No.7802-6 - 2019/04/02 (火) 19:52:23 - 軟骨魂 皆さまありがとうございます。 今回の細胞株であるATDC5細胞は通常状態では線維芽細胞の形態を示しますが100%confluenceになったあとインスリン 存在下で培養すると軟骨基質を構成する細胞外マトリックスの発現が上昇して初期軟骨細胞へと分化し，さらに培養を続けると後期軟骨分化をへて軟骨基質の石灰化が生じ肥大軟骨細胞へと分化する細胞株です。lipofectuneでの遺伝子導入は報告させていますがほとんど48時間以降のことは書いていません。それでも28日まで培養して形態的評価しています。Medium変えるときに行っているものもあれば10日後に行っているものもあります。 自分もlipofectamineは96時間までとは思っていましたが記載がないことをみると一回だけで続くものなのか知りたくて投稿させて頂きました。やはり安定株を樹立してからの方が無難ですかね？

(無題) 削除/引用 No.7802-5 - 2019/04/02 (火) 12:12:55 - み >[Re:3] みさんは書きました : > そもそも一過性だとせいぜい72−96hくらいしか発現は保たれないでしょう。 一部、以下のように訂正しておきます。 contact inhibitionやpost-mitoticな状態になるなら１回目の導入効率さえ十分高ければ４週間後でも発現が保たれているかも。 primary neuronでは４週間持続するからね。 でも先にも書いたように自分ならstable作る。

(無題) 削除/引用 No.7802-4 - 2019/04/02 (火) 10:06:22 - 独り言 使用する細胞は１００％コンフルで増殖が停止するものですか？ リポフェクションはプラスミドを細胞質内に送り込めますが、核内に入るにはM期の核膜崩壊後に入るといわれています。そのため増殖中の細胞のほうが導入効率がよいです。 リポフェクションは一般的に３日程度を発現ピークとする一過性発現ですが、これは細胞分裂するほどプラスミドが希釈されていく要因が大きいと思います。そのため原理的には、増殖が遅い細胞ではより長い期間発現できるかもしれませんが、さすがに２８日間は困難だと感じます。 どちらにしても、条件が普通ではないので、自分で試したり、同じようなことをしている論文がないかしっかり調べてみないとわからなそう。 リポフェクションがそれほど毒性ない条件であれば、２８日間に繰り返し行うことは実験上可能でしょう。 でもレンチウイルスで導入することが一番綺麗で確実でしょうねぇ。

(無題) 削除/引用 No.7802-3 - 2019/04/02 (火) 09:49:50 - み そもそも一過性だとせいぜい72−96hくらいしか発現は保たれないでしょう。 またコンフルエント後は導入効率悪いでしょうね。 lipofectionによる分化した細胞への導入も細胞種によっては殆ど入らないかも。 現実的にはウイルスベクターや安定発現用ベクターで安定発現細胞を作製しておいてから分化誘導でしょう。 Tet-ONなんかで誘導型にしておく方がさらに良い。

(無題) 削除/引用 No.7802-2 - 2019/04/02 (火) 09:37:02 - かか 一般的にトランスフェクション試薬を用いた場合の発現は一過性である (プラスミドがゲノムに組み込まれない) ため、長期の影響を見るのであればレンチウィルスベクターか何かを用いたほうがいいです。 あと試薬を用いたトランスフェクションは細胞がよく成長している時期のほうが効率よく入るので、100%コンフルエントになる前に仕掛けたほうがいいです。

LipofectamineでのTransfectionについて 削除/引用 No.7802-1 - 2019/04/02 (火) 07:30:16 - 軟骨魂 教えてください！！！ 現在ATDC5で軟骨分化誘導させる実験を検討しています。ATDC5はインスリンを含むITSで軟骨分化誘導させDay28まで育てて形態的な観察を検討しています。 その際Lipofectamine 2000にて標的遺伝子を導入を予定しています。Day3に100％ConfluenceになったらTransfectionをして48時間後にRNA,蛋白を抽出予定です。以後Mediumは2日おきに培地交換をします。ただその後形態を観察していくのですがDay28までDay3に行ったLipofectamineでのTransfectionはその1回でいいのでしょうか。もしくはMedium交換のたびにLipofectamineを用いてTransfectionしたほうがいいのでしょうか？ どなたかLipofectamineで一過性の遺伝子導入における48時間以降のTransfectionについてご意見いただけたら助かります。

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