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(無題) 削除/引用 No.7767-15 - 2019/03/15 (金) 16:58:07 - しー 他の方が指摘するように ・ポンソーで見える＝転写まではOK（目的物かどうかは断定できませんね） ・泳動する蛋白量が多すぎて白抜けが起こっていると推察されます。 Lysateが余っているなら、レーンごとに泳動蛋白質量を変えて、推奨濃度での抗体反応を行ってみる。（数μg〜60μgまで） 上記で解決しないなら、対象のバンドが目的物ではない、あるいは抗体がWorkしていないことが考えられます。 見たいものがメジャーな蛋白質であれば、論文等で実績のある泳動蛋白質量と使用抗体を参照し、その条件で泳動→抗体反応を行う それでも見えないなら、目的物でない可能性が高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.7767-14 - 2019/03/15 (金) 16:24:18 - おお >[Re:11] まっくろんさんは書きました : > 　「目的部分が白くなる」とのことなので，サンプルが多すぎて，白抜けしている可能性があるのではないでしょうか。段階希釈したサンプルを流してみてはどうでしょう。抗体濃度も推奨濃度以下でいいと思います。 そうかも知れません。または蛋白がいっぱい乗っているところは目的のタンパク質でなければ、ある種ブロッキング効果がありその部分のバックグランドが周りに比べて低いことがあります。 まえのコメントで書かなかったのですが、６０マイクログラムのLysateであってもちょっとのせすぎているかなっという気がしなくもないです。少ないほうが バンドがシャープになり検出感度が高くなることもあると思いますので。 その抗体はもしかしたら組織から検出できるほど感度を上げられない可能性はあるのかもしれません。ただし抽出方法の工夫などで見えるようないなることもありえます。逆に指摘があるように目的の蛋白が抽出しきれてないこともあったり。 低分子量といっても１５kDaくらいならPVDFを使っていればそんなに問題は起こらないと思います。わたしは１０kDaあたりのものもみますが、Tris-Tricineの系を使っているぐらいであとは通常のWB（他の蛋白）と一緒です。

(無題) 削除/引用 No.7767-13 - 2019/03/15 (金) 13:02:57 - *** 293に目的タンパク質を発現させたものを流してポジコンにしてみれば、発現量の問題なのか、もしくはそもそもその抗体が使えないのかはわかると思います。

(無題) 削除/引用 No.7767-12 - 2019/03/15 (金) 12:47:11 - み >[Re:9] skさんは書きました : > 皆さんご意見ありがとうございます。 > > まず一次抗体に関してですが、購入先でWBに使用可能なことは確認済みです。 > また抗体濃度は推奨の倍の濃さまで試していますが、検出できませんでした。 データシートに使用可能と書いてあっても（WB dataが掲載されていても）本当にWorkする抗体かどうかは信用できません。そのバンドがKOやKnockdownで消えているのでしょうか？またあなたが見ようとしている組織と同じサンプルで検出されているのでしょうか。 > その際に目的部分のみ真っ白になる現象が起きているのですがこれはどのように考えればいいのかご教授願えますか。 > オーバーロードか転写のムラか。 または周りのシグナルが単なる洗浄不足によるノイズなのか。 > またタンパク質は組織抽出したものを使用しています。 > > 私たちの研究室では低分子量のタンパク質を見るのが初めてで細かい部分が定まっていません。ですので泳動条件などから教えていただけると幸いです。 > 抗体がworkしないものである可能性に加えて、あなたが調製した抽出物側にも問題があることは否定できませんね。抽出される条件なのか。発現量は十分存在するのか。ポンソーて見たというのは単にその分子量領域の蛋白群は膜に転写されていたということだけで標的蛋白も含まれるかどうか不明。 本来Westernならポンソーで染まらない量でも検出できるはずだけど。 ポジコンとして強制発現ベクターでも作ると良い。

(無題) 削除/引用 No.7767-11 - 2019/03/15 (金) 12:12:40 - まっくろん 　「目的部分が白くなる」とのことなので，サンプルが多すぎて，白抜けしている可能性があるのではないでしょうか。段階希釈したサンプルを流してみてはどうでしょう。抗体濃度も推奨濃度以下でいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.7767-10 - 2019/03/15 (金) 12:12:35 - あ 組織から抽出したタンパク質を流しただけなら、目的の位置に見えるバンドはノンスペであってもおかしくないような気がしますが

(無題) 削除/引用 No.7767-9 - 2019/03/15 (金) 11:00:08 - sk 皆さんご意見ありがとうございます。 まず一次抗体に関してですが、購入先でWBに使用可能なことは確認済みです。 また抗体濃度は推奨の倍の濃さまで試していますが、検出できませんでした。 その際に目的部分のみ真っ白になる現象が起きているのですがこれはどのように考えればいいのかご教授願えますか。 次に二次抗体やECLですが、コントロールとしてtublinの発現も同時に見ていて、そちらの発現は確認できているので問題ないかと考えています。 またタンパク質は組織抽出したものを使用しています。 私たちの研究室では低分子量のタンパク質を見るのが初めてで細かい部分が定まっていません。ですので泳動条件などから教えていただけると幸いです。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.7767-8 - 2019/03/14 (木) 16:48:18 - おお あと抗体濃度はあげれるだけあげてもいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.7767-7 - 2019/03/14 (木) 16:42:17 - おお そのタンパクは精製したものを流しているの？ そうでなくて、なんかLysatesを流していたらポンソーで見たバンドはあなたの目的のものでない可能性はありますよね。 精製したものを６０マイクロｇも流しているとなるとなんだかむちゃくちゃ流してるなって言う感じだけど。 Lysateであれば目的のたんぱく質が発現していると思っている根拠は？それがはっきりしないならポジコンになるものは？ その抗体は購入先でWBで使えるかどうか記載はないの？カタログに実際検出したデーターが載ってない？ 二次抗体、ECLキットなどはワークしているの？　Lysatesだと検出感度が結果に大きく左右されるけど、検出系は？　フィルム使ってるとか、ECLキットはどれとか。 ブロッキング剤は特にスキムミルクなどだと、ちょっと抗体反応が室温で長いと環境によってはバクテリアが生えてきてだめになる事がある。 Total lysatesでそのあたりのメジャーなポンソーで検出できそうなたんぱく質はヒストンかな。

(無題) 削除/引用 No.7767-6 - 2019/03/14 (木) 16:18:24 - ぽんそー 転写後の操作でミスが起こるようなことはないと思いますが.. みさんのおっしゃる通り、試薬の問題でしょう。 抗体がしっかりしたものである保証があれば、検出試薬でしょうね。 見たいタンパクの抗体は何種類も売っているものですか？

(無題) 削除/引用 No.7767-5 - 2019/03/14 (木) 16:10:43 - み ポンソーで見えているバンドが本物なら抗体による検出が上手くいっていないのでしょう。 一次抗体、二次抗体、最後の検出試薬の質を確認すべきでしょう。 ポンソーで見えているバンドが本物である保証はあるのかなあ。

(無題) 削除/引用 No.7767-4 - 2019/03/14 (木) 16:08:56 - sk ぽんそーさん 転写後はTBS(Tween含有)で洗浄後、2％ブロッキング剤でブロッキングしています。 抗体に問題があるのは考えられますが、抗体以外に問題点があるとしたらいかがでしょうか

(無題) 削除/引用 No.7767-3 - 2019/03/14 (木) 16:05:59 - ぽんそー ポンソーで確認できるのであれば転写はうまくいっているということですよね。 転写後の操作はどのようにしていますか。 抗体に問題があるような気がしますが...

(無題) 削除/引用 No.7767-2 - 2019/03/14 (木) 16:05:21 - sk 追記 メンブレンはPVDFを使用しております。 転写時間は2時間です。

低分子量のウエスタンブロット 削除/引用 No.7767-1 - 2019/03/14 (木) 15:51:38 - sk お世話になっております。 低分子量(14〜16kDa)のタンパク質をウエスタンブロットで検出しようとしたのですが、バンドが全く確認できません。 条件としては60µg/1レーンでアプライし、10〜20％のsupercepゲルを使用し700ｍA、200V、90分で泳動しております。 転写後、ポンソーでバンドを確認したところしっかりと目的の位置にバンドを確認することができました。 抗体に問題があることも考えられますが、実験操作上で改善できるような箇所はありますでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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