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Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用 No.7755-27 - 2019/05/13 (月) 22:22:14 - アップルキッド ねこさん、ご意見ありがとうございます。 初心に帰って論文を再度読んでみます。 皆様、多くのご意見を頂き誠にありがとうございました。その後のご報告をさせて下さい。 研究室の他のメンバーに私が使ったものと同じ試薬(基質、ネルソン試薬、ソモギー銅液)で実験をしてもらったところ、私が得られた結果と同じ様に、酵素(高濃度)の活性値は酵素(低濃度)から算出される値よりも低く、検量線は直線になりませんでした。また、私が調整した基質とは別の基質でも実験を行なってくれましたが、同じ結果でした。 このことから、今回の問題がヒューマンエラーやテクニカルによる人為的なものでは無く、対象の酵素が「生成物阻害」によって酵素活性に影響を及ぼしていると結論付け、上司に報告致しました。 私のテクニカルが原因では無いことに胸を撫で下ろしております。研究室内では新参者の私に原因があるのでは…と疑う雰囲気ヒシヒシとしておりましたので。 ただ、皆様にはいろいろと原因を考えて頂いたにも拘わらず、初歩的な生成物阻害が原因だったことに申し訳無く思っております。 前任の当時の実験記録やデータを調べたところ、ノートには酵素を3種類の濃度で行なっているのに、データ上ではそのうちの2種類を抜粋して検量線を引いていたり、ノートでは複数回行なっていると推測される描写があるのに、データ上では相関係数(R2値)が高いグラフの1回分の結果しかなかったりしていました。 憶測ですが、意図的に(或いは無意識かもしれませんが)実験結果を抜粋した結果、検量線が直線に乗ったのではないかと思われます。 漸く実験を先に進めることができます。このトピックにご意見を頂きました皆様、本当にありがとうございました。

解決済みかな、とも思いますが…。 削除/引用 No.7755-26 - 2019/05/01 (水) 00:30:08 - ねこ モリブデン酸溶液(だったはず)が抹茶色に劣化しやすかった印象が有りますが、いかんせん数年前に学生実習でTAした程度なので…。何もトラブルなく終わってしまいましたし。

解決済みかな、とも思いますが…。 削除/引用 No.7755-25 - 2019/05/01 (水) 00:25:36 - ねこ 原著や、参考になりそうな文献に立ち戻った方が良いのかな、とも感じられたので。参考になりそうな文献のみ示させていただきます。有名なので既に読んでるとは思うのですが…。文献読んでいたりして、あれ?となることが有りますので。 https://www.jstage.jst.go.jp/article/kagakutoseibutsu1962/3/9/3_9_484/_pdf https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9012/9012_yomoyama_2.pdf

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用 No.7755-24 - 2019/04/01 (月) 10:49:17 - アップルキッド cDNAさんご意見ありがとうございます。 STDの検量線の値は過去の数値範囲内です。 STDはストック溶液を保存し、実験の度に使用濃度に段階希釈しております。 先日の実験で丁度このストック溶液を使い切ったので、新たにストック溶液を調製しました(ストック溶液を作る為の元ネタ溶液は同じですが…)。 これで直線に乗ってくれればいいのですが… >以前と、検量線の吸光度が似た値なら酵素反応の条件に問題があり、吸光度がもし低いならSomogyi-Nelson法の試薬に問題があると考えるしかないように思いますが、どうでしょう。 STDの検量線の値が従来通りなので原因は酵素反応の条件に問題がありが濃厚でしょうか？BUfferか基質かなら、基質が原因ですかね… 他の研究で忙しいので直ぐには無理そうですが、研究室の他の方にSomogyi-Nelson法を代わりにやってみてもらえないかお願い致しました。 チューブの件ですが、試しに空チューブ数個をいつもの様に煮沸(20分+α)してみたところ、中に水が入っている様子はありませんでした。煮沸中に水が入ったことが原因では無い様です。

(無題) 削除/引用 No.7755-23 - 2019/03/28 (木) 18:51:50 - cDNA 難しい状況ですね。 以前のデータと検量線の吸光度のデータは似た値でしょうか。 低濃度で直線から外れる問題を解消したいですが、出来ることとしては試薬を再購入するか、自作してみる事ぐらいしか思いつきません。 以前と、検量線の吸光度が似た値なら酵素反応の条件に問題があり、 （とは言っても反応バッファーと基質ぐらいですか？） 吸光度がもし低いならSomogyi-Nelson法の試薬に問題があると考えるしかないように思いますが、どうでしょう。 酵素の高濃度での色が以前より薄いということなので、酵素反応が進んでいないか発色反応が進んでいないかのどちらかですよね。 ちなみに、本当に何も思い当たる節が無い場合、私はまず水を疑います。次に、最初に問題視されていたチューブでしょうか。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用 No.7755-22 - 2019/03/26 (火) 17:21:55 - アップルキッド DMRさんご意見ありがとうございます。 測定波長が660nmでは無いのでDMRさんのご経験時の値と違うかもしれませんが、酵素(無し)が0.06〜0.1、酵素(低濃度)で0.2を超えるぐらい、酵素(高濃度)で0.3に届かないぐらいです。 以前はネルソン試薬を加えると、酵素(無し)が黄緑色、酵素(低濃度)が緑色、酵素(高濃度)が濃緑〜青緑色と目視でも生成される還元糖が違うことが分かったのですが、現在は酵素(高濃度)と酵素(低濃度)が殆ど同じ発色状態です。

(無題) 削除/引用 No.7755-21 - 2019/03/26 (火) 08:33:59 - DMR 五月雨式にすいません。 あとは、生成物阻害で酵素活性が低下してるとか。

(無題) 削除/引用 No.7755-20 - 2019/03/25 (月) 18:26:06 - DMR ちょっと気になるのだけど、還元糖の生成量ではなく、吸光度の生の数値（A660nm)の値はどんなもんでしょう？ 経験的に、A660=1.0以上は、あんまりあてにならないと思っています。 それは、入射光に対し、透過光が極めて少なくなるからです。 発色が高すぎて、飽和しているのかもしれません。 A660が1以下なら無視してください。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用 No.7755-19 - 2019/03/25 (月) 17:34:13 - アップルキッド cDNAさんご意見ありがとうございます。 此方でご質問した結果、同条件(N=2)間の数値の乱れが、Somogyi-Nelson法の高感度に由来するもので、取り扱いを注意すれば許容範囲内にできると云う点は解決致しました。気を抜くとまだまだ乱れることはありますが…(私以外の測定者もブレてます)。Somogyi-Nelson法がそういうものだと分かったので、そこは対処できそうです。 そして現在の問題点は、酵素(高濃度)の発色が従来に比べて悪く(還元糖があまり生成されていない)、プロットした際に綺麗な直線に乗らない、ギリギリ許容範囲内で乗ったとしても活性値が従来に比べて低く出ることです。 勿論、測定している酵素の活性値が保存している間に低下したと云うことも考えらますが、作った時期が違う酵素が軒並みこの現象に陥っているので何か別の原因があるのではと考えております。 検量線が原点を通るか通らないかの件ですが、STDの検量線は原点を通りません(切片=0では無い)。最も低濃度側が直線から大きく外れておりますが、高濃度も小さい方に外れ易いと云うことはありません。 この低濃度側付近が(STD濃度換算で)酵素の測定範囲となります。 >活性測定の時間と温度管理に問題がないか とのご指摘ですが、私が担当する前から何年も同じ温度・時間で測定しておりまして、もしここに不備を指摘することになれば、大掛かりな手続きと共に明確な根拠を示さないと他のメンバーが納得しないと思います。 なので取り敢えずは他の原因を潰してから考えたいと思います。 反応溶液全量に添加する酵素の体積は僅かなので温度の影響は殆ど無いと思います。酵素は最後に添加しております。 反応中の体積及び添加の順番は引き継ぎ資料通りに特に変更せずに行なっております。 >混合直後、反応初期のみやたらと活性が高い酵素の場合、反応時間を短くするとデータが安定しにくくなります。 そう云うこともあるんですね。勉強になります。 酵素反応の反応停止は氷上で冷却のみで、厳密には止まってないです。なのですぐに冷やしたソモギー銅液を添加して発色反応の操作を開始させてます。 酵素反応終了後、液が冷めるぐらいは冷却させてますが、この段階で放置させたりはしていません。寧ろ手際が良くなって以前よりもスピーディに次の段階へ操作移行しているつもりなのですが…

(無題) 削除/引用 No.7755-18 - 2019/03/22 (金) 19:00:39 - cDNA しつこくてすみませんが、もう一度、何が解決したのか整理してもらえますでしょうか。 (1)検量線は最も低濃度のみが直線から値が大きい方に外れ、高濃度は問題ないのか、高濃度も値が小さい方に外れる傾向があるのかないのか 場合によっては一般的な検量線の範囲にこだわらず、まずは広くとって、使える範囲に限定するのも一つです。 (2)検量線は原点を通る回帰か通らない回帰か。原点を通る必要はありません (3)検量線が一定範囲では使えるとして、その範囲で酵素活性を測定する場合、活性測定の時間と温度管理に問題がないか 酵素は氷上で冷やしてあると思います。酵素反応は30度なり40度なりかと思いますが、反応液全量に対して酵素溶液の体積が大きくなると混合時に温度が下がります。許容範囲は無理して最大で5%ぐらいだと思っています。もちろん反応時間にもよりますが反応時間が短いほどこの影響は大きいでしょう。 反応も最後に基質を加えるか、最後に酵素を加えるかでも変わってきます。 また、混合直後、反応初期のみやたらと活性が高い酵素の場合、反応時間を短くするとデータが安定しにくくなります。 今回の問題と関係あるとは思いませんが、酵素反応の反応停止が何によるかでも結果は変わり得ます。瞬時に反応が止まる方法がベストですが。 現在の酵素低濃度と高濃度でそれぞれ反応時間を振って、経時変化を見ると問題点が分かるかもしれません。吸光度変化をリアルタイムで測定できる系だとこの手の実験も楽なのですが、反応を止めるので、難しいですよね。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用 No.7755-17 - 2019/03/22 (金) 17:03:35 - アップルキッド cDNAさんご意見ありがとうございます。 >検量線については、還元糖なしをブランクとして引いているのでしょうか？ 還元糖無しをブランクとして引いた値から検量線を引いております。 >実験以外で検証が必要な部分としては、基質量が間違っていないか、というところでしょうか。 実は既にDNS法を試しに…云々の下りで「基質が原因なのでは？」と思い、新たに調製し直して実験していました。それであの通りの結果です。 実験ノートを読み返しても濃度を間違えた様子も無く、新たに作り直した時も他のメンバーに確認の上で作製しました。 また、酵素反応は基質過剰ですが「酵素(高濃度)時に基質が足りないのでは？」と思い、試しに敢えて通常の100倍以上濃い酵素で反応させて呈色を確認しました。その結果から、現在の希釈率では酵素(高濃度)で基質が足りないと云うことは無いと思われます。まだ十分に還元糖が生成可能です。 お恥ずかしい話ですが、私も他の研究仲間もお手上げ状態だったので此方でご意見をお伺いしました。 投稿する前はネルソン試薬やソモギー銅液に原因があると思っておりましたので、試薬の劣化云々…をお聞きしました。

(無題) 削除/引用 No.7755-16 - 2019/03/18 (月) 22:46:55 - cDNA 検量線については、還元糖なしをブランクとして引いているのでしょうか？こういうものは引くのが正しいと一概には言えないのですが、引くことによって直線に乗るなら、そちらを採用したらいいと思います。 前任者の条件を完全に信じていいかは、何とも言えません。前任者が正しいか、何か間違っているか、間違った記述を残しているか、本当のところは分かりません。 いろんな問題を解決するには必要を思われる範囲を超えて条件を振るしかないと思いますが、その辺は指導者と相談するのが一番だと思います。 実験以外で検証が必要な部分としては、基質量が間違っていないか、というところでしょうか。極端な例としては酵素量を増やしても、基質が消費され切っていれば、それ以上には生成物も上がらないので。 基質を自分で調製したということなので、濃度を間違っていないか、もしくは間違っているかもしれない前提で作り直すなどは私なら試します。酵素の反応時間を長くしたり短くしたりすることもこの検証に役立ちます。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用 No.7755-15 - 2019/03/18 (月) 18:36:09 - アップルキッド cDNAさんご意見ありがとうございます。 結果が出ず焦ってしまっていました。投稿を読み返すと分かり難いですね。 申し訳ございません。現状をまとめます。 (1)同じ条件(今回はN=2)の値はぶれるか →今回の測定では同じ条件(N=2)間に数値の乱れはありませんでした。 (2)濃度既知のスタンダードの検量線は直線に乗るか、その濃度範囲はどれほどか →いつもなら検量線の直線が各点に接する様な感じで引けますが、今回は低濃度側の1点が外れております。何回もやり直したのですが、同じ様なプロットしか得られませんでした。 誤解を与えてしまったみたいですが、ブレが解消したのはサンプルで、スタンダードはブレと云うかこの低濃度1点が直線に乗らないと云う問題が生じています。 STDの濃度はサンプルで生成される還元糖の濃度付近を範囲に4点で検量線を引いております。 (3)酵素活性は適切に測れているか →前任の実験ノートの記載が間違っていないことを前提としますが、今回測定している酵素では基質の濃度、酵素の希釈率、酵素反応時間に関しまして検討の上で実験方法が確立されております。 今まで問題無く測定できていたのに、急に高濃度側が低く見積もられる様になったのか皆目見当がつかなく困っております。

(無題) 削除/引用 No.7755-14 - 2019/03/15 (金) 17:05:06 - cDNA 最初に戻って、問題点を切り分けてみた方がいいのではないでしょうか。 (1)同じ条件(今回はN=2)の値はぶれるか (2)濃度既知のスタンダードの検量線は直線に乗るか、その濃度範囲はどれほどか (3)酵素活性は適切に測れているか (3)はあくまで(1)(2)に問題が無いことが前提じゃないと議論しても意味がありません。スタンダードのぶれが大きいということでは無かったでしょうか。今回はそれは解消したという意味でしょうか。 仮に(1)(2)の問題が解決済でしたら、酵素活性を測定するには適用出来る適切な濃度範囲はどうしても有限で、現状で既に広すぎれば酵素の高濃度で低く見積もられることはよくあります。または基質が酵素活性に影響を与えるほど低くなっていたり、生成物が阻害する場合には生成物濃度が上がり過ぎれば当然低く見積もられます。 酵素濃度を決めるのは、これらの問題が無い範囲を調べるためのもので、この条件検討には酵素反応時間も当然含まれます。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用 No.7755-13 - 2019/03/15 (金) 12:49:18 - アップルキッド cDNAさん、DMRさんご意見ありがとうございます。 昨日、Somogyi-Nelson法と同時にDNS法も行なってみました。 >精度が高く、酵素調整、活性測定のどこかを手抜きするとそれが如実にわかる測定法 とのことだったので、酵素希釈、酵素反応、呈色反応時に誤差が出ない様に注意して取り扱いました。 また、 >30分以上置いたら色が安定したりしませんかね？ のご意見もあったので、ネルソン試薬を加えてから30分間静置させました。 >加熱後、急冷してからネルソン試薬を加える のご指摘ですが、前の投稿で実験操作をざっくりとしか書かなかったのですが、煮沸20分間させた後に氷上で冷却して室温程度に戻ったらネルソン試薬を加えています。 Somogyi-Nelson法の結果ですが、サンプル(酵素有・無)の2個間のバラつきは殆どありませんでした。 ただ相変わらず、酵素濃度が高い方のサンプルでは生成される還元糖が低く出ます。その為、線形近似曲線を引くと酵素添加濃度が低い方のプロットは線から飛び出して、酵素添加濃度が高い方のプロットは線より下に…という感じになりまして、相関係数は低いままでした。 最早これは私のテクニカル面が原因と考えるべきでしょうか…。 DNS法の結果ですが、酵素有・無の吸光度が殆ど変わりませんでした。この酵素では検出限度的に無理がある様です。 基質のカルボキシメチルセルロースですが、実験前に遠心は行なっておりません。瓶に入っているのを必要量ピペットで吸い上げて使っておりました。 そして、このご指摘で思い出したのですが、再現性が取れていた時期は研究室に置いてあったCMC(3年以上前に作製)を使用していたのですが、今現在実験に使っているのは最近私が作製したものでした。

(無題) 削除/引用 No.7755-12 - 2019/03/14 (木) 10:10:15 - DMR ソモネル法は学生時代にさんざんやりました。 精度が高く、酵素調整、活性測定のどこかを手抜きするとそれが如実にわかる測定法でした。 DNS法の下りは、とりあえずそちらで同様の操作を実行し、ばらつきが出るようなら活性測定の方法（酵素調整、基質調整、反応系）に問題がある、そうでなければ試薬の問題（もちろん、発色操作に問題があるのかもしれないが）を切り分けるために提案しました。 そういえば思い出しました。ソモジネルソン法は基質（カルボキシメチルセルロースとか）によっては複合体が出来て沈殿が生じますが、測定前に遠心はしてますか？

(無題) 削除/引用 No.7755-11 - 2019/03/13 (水) 19:47:21 - cDNA ＞また、本来はネルソン試薬を加えたら発色の安定を待つ為に30分程度置きますが、研究室の慣例的に待たずに測定しております(個人的に即測定するのはどうかと思うのと、準備に手間取るのでだいたい15分後ぐらいに測定しています)。 との事ですが、30分以上置いたら色が安定したりしませんかね？ また、加熱後、急冷してからネルソン試薬を加える、というプロトコールもあるので、急冷してみては如何でしょうか。

Somogyi-Nelson法による還元糖の定量について 削除/引用 No.7755-10 - 2019/03/13 (水) 19:04:44 - アップルキッド DMRさん、おおさんご意見ありがとうございます。 酵素無し(代わりにbuffer)の吸光度及びSTD無し(代わりにMilliQ)の吸光度の件ですが、どちらも実験を行なう度にバラつきがあったり無かったりと安定しません。 2個ずつ作製(N=2)おりますが、この2個間で同じ様な数値が出ることもあれば、両者でかなり数値が異なることもあり、実験を繰り返す度に数値は変動します。 普通ならブランクは殆ど一定の数値になりますよね… これは今回再現性が取れない以前にも見られた現象だったので、Somogyi-Nelson法自体が他の還元糖の定量法に比べて再現性が取れ難い(テクニカル誤差がシビアな)方法なのかと思っていたのですが、どうなのでしょうか？ もし、Somogyi-Nelson法をご経験されていたらご教示下さい。 >別の還元糖測定法を試されてはいかがでしょうか 酵素によってはDNS法やシステイン-カルバゾール-硫酸法を用いて還元糖の定量しております。 本実験の目的が、以前に活性測定した時(Somogyi-Nelson法)の値と今回の活性値がどう変化しているのか？と云うことなので、残念ながら他の方法では行なえません。 この酵素をどうして危険物を使うSomogyi-Nelson法で行なったのか、前責任者に小一時間問い詰めたい程です…。。

(無題) 削除/引用 No.7755-8 - 2019/03/13 (水) 00:43:45 - おお ブランクはどうでしょう？

(無題) 削除/引用 No.7755-7 - 2019/03/12 (火) 22:16:24 - DMR そうですか。 それでは、すぐやれるのであれば、別の還元糖測定法を試されてはいかがでしょうか。例えばDNS法とか。 その結果を比較すれば、酵素、あるいは測定系に問題があるのか、試薬の問題なのかが切り分けられるはずです。 ところで、酵素無しの基質ブランクの吸光度はいかがでしょうか？ 案外、酵素反応の緩衝液にトラブルの原因があるのかも？ まぁ根拠はありませんが。

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