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(無題) 削除/引用 No.7732-12 - 2019/03/20 (水) 04:20:27 - 最強の素人 リドカインを試す。細胞骨格に効くはず。 マクロファージやＤＣでよくはがれた記憶があります。 何の細胞か知りませんが、ＥＤＴＡではがれるってのも気休めの都市伝説程度のことがあるでしょう。 それよりはリドカインは効きます。％など覚えていませんが、刺激後のべったり張り付いていたマクロファージとＤＣがＯｎ　ＩＣＥ＋リドカイン後にパイペッティングで綺麗に剥がれたのを覚えています。 その後のフローでのメーカーの異変もありませんでした。 ＤＣのヒトの中ではそこそこ知られている方法らしいいです。 参考までに。

(無題) 削除/引用 No.7732-11 - 2019/03/07 (木) 13:32:15 - おお この手の事はやらないからわからないのだけども、細胞はどれくらいのConfluencyで回収してますでしょうか？ 低いほうがもともと隣の細胞が少ないのでクランプが出来にくいと思うのですが、、、

293なら 削除/引用 No.7732-10 - 2019/03/07 (木) 13:03:19 - 7744 ピペッティングだけでもdishなどからは全部剥がせると思います。 継代ならそれだけで充分いけます。 継代時にしかやったことはありませんが、しっかりピペッティングすればFACSできるぐらいにはバラバラになるかもしれません。 ラボの２９３の性状によっては無理かもしれませんが。。。

(無題) 削除/引用 No.7732-9 - 2019/03/07 (木) 07:52:54 - えdrgvybh アキュターゼとかは。調べてみて。 たしかそういう時のために使うんじゃないかなと。

(無題) 削除/引用 No.7732-8 - 2019/03/07 (木) 04:59:26 - おお Poloxamer 188 solution https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p5556?lang=en&region=US こういうの使えないかな

(無題) 削除/引用 No.7732-7 - 2019/03/07 (木) 02:18:44 - mom （文字化け、すいません） どこかで拾ったレシピ：試したことはありません。 Trypsin in Citrate Saline Solution 10.0 g/L Potassium Chloride 1.0 g/L D-glucose 5.0 g/L Trisodium Citrate 2.5 g/L Porcine Trypsin 293細胞なら、クエン酸のキレート作用でTrypsinなしで剥がれかも。

(無題) 削除/引用 No.7732-6 - 2019/03/07 (木) 02:16:37 - mom どこかで拾ったレシピ：試したことはありません。 Trypsin in Citrate Saline Solution • 10.0 g/L Potassium Chloride • 1.0 g/L D-glucose • 5.0 g/L Trisodium Citrate • 2.5 g/L Porcine Trypsin 293細胞なら、クエン酸のキレート作用でTrypsinなしで剥がれかも。

(無題) 削除/引用 No.7732-5 - 2019/03/05 (火) 10:03:56 - あ FACSで解析するさいの細胞を懸濁するbufferはなんでしょう？ BSAなどを入れて、細胞の吸着をおさえてはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7732-4 - 2019/03/05 (火) 08:32:05 - ストレイナー セル　ストレイナーを使っていないんですか？　シングルセルにする必要はないこともあります。条件によってはダブレットを検出できるから。 トリプシンで壊れているかどうかはウエスタンでチェックしていますか？ ロスについては、固定したならば、最高スピード（瞬時　もしくは気の済むまで）遠心、洗浄液にシーラムを入れたらいかがでしょう。モノによるので、適さないこともたまにあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7732-3 - 2019/03/05 (火) 04:22:10 - Mac EDTAの濃度や処理時間はいかがでしょう？　処理直後の細胞の状態を顕微鏡で見るとシングルセルになってますでしょうか？　印象としては、死細胞からのゲノムDNAで細胞が凝集し、遠心しても落ちてこないのでロスしてるような気がしますが、、、 細胞表面FACSの場合、トリプシンは避けた方が良いと思います。私自身は5mM EDTA (in PBS)で剥がしてますが、過去ログではトリプシンより選択的（？）な酵素剤と思われるTrypLEやAccutaseが勧められているようです。下記参照。 ttp://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1265

(無題) 削除/引用 No.7732-2 - 2019/03/05 (火) 02:20:11 - F 細胞のロスはEDTAが原因なのでしょうか？トリプシンを使って染色すると一応結果は出て機械詰まりもないけれど、トリプシン処置をEDTAに変えただけで細胞ロスになるということですか？

EDTAで細胞を剥がすとフローサイトが壊れる 削除/引用 No.7732-1 - 2019/03/05 (火) 01:59:53 - FCM お世話になります。 膜タンパク質の発現を確認するためにフローサイトメトリーを行なっています。 従来トリプシンを使って細胞を剥がしていましたが、トリプシンはだめなんじゃないか？との指摘を受け、EDTAで細胞を剥がそうとしています。細胞は293細胞で、比較的剥がれやすいです。 しかし、染色、遠心の操作により細胞がどんどんロスし（300xg、3分）、また、フローサイトがたいへんよく詰まります。顕微鏡で覗くと確かに大きな細胞クランプが残っています。 なんとかシングルセルレベルで細胞を剥がすことのできる非酵素的処理剤をご存知ありませんか？ シェアしていただけますと幸いです。

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