BioTechnicalフォーラム [TNF-α刺激が入りません。]

TNF-α刺激が入りません。

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No.7730-TOPIC - 2019/03/03 (日) 22:05:36 - SNP

3T3-L1前駆脂肪細胞を使用し、TNF-α(10ng/mL)による刺激を行っています。しかし、刺激が入らず、困っています。
プロトコル等を精査しましたが、原因が不明です。考えられる原因をご教授ください。
　

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No.7730-7 - 2019/03/10 (日) 05:29:06 - 真夜中の三銃士

見た感じ、IL-6の発現量と仰られているので、RNAで見ているんでしょうか。その場合、IL-6は24時間では普通は下がると思います。TNF-aのシグナルは即効性ですし、TNF-a自体、その低濃度で長時間持続するとも思えません。

ELISAなら12-24時間、RNAなら3-6時間がまず試すスタンダードレンジと考えています。IntraできるならIL-6を細胞内でとらえてしまうのも可です。この場合、時間は十分であれば特に問題にはなりません。Protein transportを抑えれば、IL-6ならかなり見えるはずです。

その細胞のTLR4発現は知りませんが、LPSなどのuniversal stimulatorを使えたら確実なポジコンでしょう。

(無題)

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No.7730-6 - 2019/03/05 (火) 00:57:55 - とと

>[Re:3] SNPさんは書きました :
> 12時間血清飢餓状態にし、そこへ遺伝子組み換えマウス由来のTNF-αを最終濃度10ng/mLで添加し、24時間後に実験を行っています。
> 指標は、IL-6の発現量です。
> ポジコンとネガコンは用意してあり、それぞれデュプリで行っています。

ポジコンとネガコンはワークしてるのですか？刺激から24時間後に実験を行うとありますが、この時間までIL-6の発現量は刺激前と比べて変化があると確認済みですか？刺激してから24時間後が時間がたちすぎのような気もします。

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No.7730-5 - 2019/03/04 (月) 05:55:38 - おお

＞TNF-α(10ng/mL)
実際何処の商品化開示できますか？
ユニット表示は示されていますか？重量より活性ユニットのほうが現実的なので。

ポジコンはどういったコントロールでしょうか？そのコントロールでTNF-α(10ng/mL)の活性が証明できるコントロールでしょうか？それとも細胞がIL-6を分泌する機能を示すようなコントロールでしょうか？またはELISAがちゃんと計れているというコントロールでしょうか？

そのTNF-αの活性がないと結論付けれるようなコントロールがあるなら、一度購入したメーカーに相談してみるのもありかと思います。

(無題)

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No.7730-4 - 2019/03/04 (月) 03:38:27 - ぺんぺん

遺伝子組換えとありますが、機能的でしょうか？大腸菌で発現させたものだったりしませんか？

受容体の発現は確認されていますか？

LPSをポジコンに用いることはできますか？

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No.7730-3 - 2019/03/03 (日) 22:25:16 - SNP

12時間血清飢餓状態にし、そこへ遺伝子組み換えマウス由来のTNF-αを最終濃度10ng/mLで添加し、24時間後に実験を行っています。
指標は、IL-6の発現量です。
ポジコンとネガコンは用意してあり、それぞれデュプリで行っています。

(無題)

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No.7730-2 - 2019/03/03 (日) 22:21:00 - ぺんぺん

刺激とは？
ポジコンネガコンありますか？
マウス由来のtnfaですか？