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(無題) 削除/引用 No.773-9 - 2012/07/24 (火) 01:43:02 - ab shRNAではなくてDicerで処理されたsiRNAを検出したいのですね。 原理的にはmiRNAと同じ方法でsiRNAもqPCRで見れるはずですし、"siRNA qPCR"とかで検索すればいくつか情報が見つかります。 Dicerで切断される前のshRNAの発現は、pre-miRNAと同じ原理でできると思います。 プロモーターの問題であれば、miRNAベースのRNAiを使えばGFPとsiRNAを同じプロモーターで発現できます。

(無題) 削除/引用 No.773-8 - 2012/07/22 (日) 09:04:43 - だるま Harmoniaさま、書き込みありがとうございます。 ＞そもそもRNAをダイレクトにPCRするのでなければ、 ＞どうやってRNA→DNAの処理をするの？ 私は以下の方法で実験した経験はないのですが、 miRNAの逆転写反応の方法として、Stem-loop RTという方法があるようです。 Stem-loop RTについては、文章で説明すると分かりづらいので、 以下のリンク先にあるポスターを見ていただけると 分かりやすいかと思います。 http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_040548.pdf ＞設計したshRNAの長さと、それを検出するPCRプライマーの長さを考えて、PCRで増えるの？ 私が使用したshRNAは、Dicerで切断後、 RISC complexに取り込まれた時点で21ntになるデザインのものです。 21ntは通常のＰＣＲのプライマーですと無理だと思います。 Ambionが提供している方法ですと 以下のような方法で行うようです。 (間違いがありましたら、ご指摘ください。) １．Stem-loopプライマーを使って逆転写反応をする。 　　（逆転写産物はstem-loopの分長くなるようです。） ２．逆転写産物に対して、10 bpのフォワードプライマー、 　　リバースプライマーとセンター部分に対するTaqmanプローブを 　　加えて、リアルタイムＰＣＲを行う。 詳細は、以下のApplied Biosystemsのサイトを参照ください。 http://www.appliedbiosystems.jp/website/jp/product/modelpage.jsp?MODELCD=97662 上記の方法は、miRNAに対するものですが、 shRNA用にTaqmanプローブを作成すれば、可能かと考えたのです。

(無題) 削除/引用 No.773-6 - 2012/07/21 (土) 14:48:00 - Harmonia 実験設計の問題だと思うけど、 １．発現していることを押さえたデータを見せて、shRNAが原因の現象と訴える ２．いろんな手段でshRNAを発現／導入して、shRNAが原因の現象と訴える 設計したshRNAの長さと、それを検出するPCRプライマーの長さを考えて、PCRで増えるの？ そもそもRNAをダイレクトにPCRするのでなければ、どうやってRNA→DNAの処理をするの？

(無題) 削除/引用 No.773-5 - 2012/07/21 (土) 05:51:07 - だるま dpさまのご指摘の通りですね。 私の最初の書き込みは、イントロが長すぎて 何か知りたいのかが分かりずらいですね。 お詫び申し上げます。 要点は、以下の通りです。 shRNAの発現をリアルタイムPCRで検出することは可能なのでしょうか？ また、miRNAを検出するのと同じ原理で検出することは可能なのでしょうか？ 以上に2点について引き続き書き込みをお待ちしております。

(無題) 削除/引用 No.773-4 - 2012/07/21 (土) 05:44:46 - だるま ＞dpさま 書き込みありがとうございます。 現在、U6プロモーターを別のプロモーターに置き換えた コンストラクトを作成中です。 また、上記に加えて、ノックアウトマウスの胚から ES細胞を取ることを計画しております。 ＞＞そこで、標的遺伝子のmRNAの発現が低下した場合としない場合で、 ＞＞shRNAの発現がどうなっているのかを知りたい ＞実験の目的がすり替わっていませんかね・・・ 今、別のプロモーターコンストラクトを作成しておりますので、 その間に原因を特定したいと考えて、今回のような投稿を させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.773-3 - 2012/07/21 (土) 03:17:18 - dp まぁ、レンチのコンストラクトを作り直すのが面倒とか、できないとかで、今ある材料でするしかないとかでしょうけど・・・。

(無題) 削除/引用 No.773-2 - 2012/07/21 (土) 03:09:47 - dp どうも先に引っかかるので、書いちゃいます。 >そこで、標的遺伝子のmRNAの発現が低下した場合としない場合で、 shRNAの発現がどうなっているのかを知りたい 実験の目的がすり替わっていませんかね・・・。 >ES細胞ではU6プロモーターはDNAのメチル化により不活性化されるとの 報告もあり、実験条件によってはshRNA自体が発現していない場合があると 不活性されないプロモーターを使って、細胞数を制御しているということを確定しようとすることが重要なことなのではないかと。

shRNAの発現確認 削除/引用 No.773-1 - 2012/07/20 (金) 23:49:24 - だるま お世話になります。 現在、レンチウィルスでES細胞にshRNAを入れて、 標的遺伝子をノックダウンしております。 ベクターはSigmaのpLKO.1-puroを改編し、puromycin耐性遺伝子の代わりに GFPを入れたものを使っております。 問題は、標的遺伝子のmRNAの発現が低下する場合と低下しない場合があり、 困っております。(実験はFACSでGFP陽性細胞と陰性細胞をソートしてきて 行いました。）うまく低下した場合、ある細胞の数が劇的に減少する ことが観察されているため、標的遺伝子はその細胞の数を コントロールしていると考えています。 このベクターではshRNAの発現はＵ６プロモーターで、 ＧＦＰはＰＧＫプロモーターでコントロールされています。 ES細胞ではU6プロモーターはDNAのメチル化により不活性化されるとの 報告もあり、実験条件によってはshRNA自体が発現していない場合があると 考えています。 そのため、PGKプロモーターとU6プロモーターの活性が 実験間で差が違っているのではないかと思っています。 そこで、標的遺伝子のmRNAの発現が低下した場合としない場合で、 shRNAの発現がどうなっているのかを知りたいと考えております。 そこで質問なのですが、 shRNAの発現をリアルタイムPCRで検出することは可能なのでしょうか？ また、miRNAを検出するのと同じ原理で検出することは可能なのでしょうか？ 以上、長文となりましたが、何卒よろしくお願いいたします。

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