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トランスフェクション後に分泌タンパク質が減少してしまう トピック削除
No.7714-TOPIC - 2019/02/24 (日) 15:29:42 - 柿安
こんにちは。
私はこれまでに293T細胞で数多くのFc融合タンパク質を作成してきました。

この2月から始めたプロジェクトで、あるタンパク質XのFcFc融合タンパク質（以下Fc-X）を作成することになりました。
プラスミドも構築でき、293Tに入れたところ、確かに分泌されました。

その後、いつも通りトランスフェクト後96時間後に無血清培地に分泌されたFc-XをプロテインAビーズで生成しました。すると300 mlの培地から100 ugほどしか得られませんでした。他のタンパク質では300 mlの培地から4 mgは回収できています。

そこでトラブルシュートを行うためトランスフェクト後の培地を各日で回収し、ウエスタンをしましたところ、培地中に認められるFc-Xは以下の通りとなりました。

day 1: +
day 2: ++
day 3: +++
day 4: +

でした。なぜかday 4で減少していました。再現性はあります。
このXは小胞体膜で働く2型膜貫通タンパク質です。Fcに融合させたものはXの小胞体内腔のドメインで、200アミノ酸ほどの長さです。

機能は未知で受容体というものがあるのかもわかりません。
なぜ分泌タンパク質が減少してしまうのでしょうか？
分解やエンドサイトーシスであればどう防ぐのが一般的でしょうか？
機能が未知なので対策を考えることが出来ず、ここでトピックを立てさせてもらいました。
どのようなコメントでも構いません。よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.7714-4 - 2019/02/25 (月) 21:20:56 - Kent
分泌されたたんぱく質が本当に減少しているなら、同時に分泌されたプロテアーゼによって分解されているか、タンパク調整の時に遠心しているなら、凝集して沈殿しているかが考えられますが、可能性は低いですが、細胞膜に結合しているか、エンドサイトーシスされているか。
可能性の高いほうを考えると、ウェスタンで分解らしきものは見えていますか？
分解なら、day2の培地を取り出し、３７度に置くとやはり分解されますか？その時インヒビターを入れると安定になりますか？凝集なら沈殿画分をウェスタンしてみますか？エンドサイトーシスのインヒビターはたくさんありますが、細胞にダメージを与えそうですので、よく考えて使う必要がありそうですが。

(無題) 削除/引用
No.7714-3 - 2019/02/25 (月) 06:03:34 - 柿安
Mac様、ありがとうございます。

＞現実的な解決策としては、day 3で回収するのが一番手っ取り早い気がします。細胞内タンパク量がどう動くかは見ておいた方がいいかもしれません。

書き損じましたが、条件検討の結果、3日目で改めて回収を行いました。
ただそれでもmgオーダーのものが得られず、また機能的でもないようです。

＞2型膜タンパクで小胞体局在となると、N末側に局在を制御するドメインがあるのか、C末の内腔側ドメインを介して他のERタンパクと結合するのか、局在のメカニズムくらいは分かると、対策を考えやすいかもしれませんね。

細胞質ドメインは3つしかアミノ酸はありません。膜貫通領域として20アミノ酸ほどがあり、その後に内腔側ドメインとなります。

確かに何か他のタンパク質を結合することで膜外輸送が阻害される可能性はありますが、それでも一旦出てしまったものが、減少するというのがなんとも耐え難いです...。

今、バキュロウイルス系に乗り換えようとしていますが、うまくいかない（収量が得られない）可能性が大だとは思います...

(無題) 削除/引用
No.7714-2 - 2019/02/24 (日) 19:32:39 - Mac
現実的な解決策としては、day 3で回収するのが一番手っ取り早い気がします。細胞内タンパク量がどう動くかは見ておいた方がいいかもしれません。

2型膜タンパクで小胞体局在となると、N末側に局在を制御するドメインがあるのか、C末の内腔側ドメインを介して他のERタンパクと結合するのか、局在のメカニズムくらいは分かると、対策を考えやすいかもしれませんね。

トランスフェクション後に分泌タンパク質が減少してしまう 削除/引用
No.7714-1 - 2019/02/24 (日) 15:29:42 - 柿安
こんにちは。
私はこれまでに293T細胞で数多くのFc融合タンパク質を作成してきました。

この2月から始めたプロジェクトで、あるタンパク質XのFcFc融合タンパク質（以下Fc-X）を作成することになりました。
プラスミドも構築でき、293Tに入れたところ、確かに分泌されました。

その後、いつも通りトランスフェクト後96時間後に無血清培地に分泌されたFc-XをプロテインAビーズで生成しました。すると300 mlの培地から100 ugほどしか得られませんでした。他のタンパク質では300 mlの培地から4 mgは回収できています。

そこでトラブルシュートを行うためトランスフェクト後の培地を各日で回収し、ウエスタンをしましたところ、培地中に認められるFc-Xは以下の通りとなりました。

day 1: +
day 2: ++
day 3: +++
day 4: +

でした。なぜかday 4で減少していました。再現性はあります。
このXは小胞体膜で働く2型膜貫通タンパク質です。Fcに融合させたものはXの小胞体内腔のドメインで、200アミノ酸ほどの長さです。

機能は未知で受容体というものがあるのかもわかりません。
なぜ分泌タンパク質が減少してしまうのでしょうか？
分解やエンドサイトーシスであればどう防ぐのが一般的でしょうか？
機能が未知なので対策を考えることが出来ず、ここでトピックを立てさせてもらいました。
どのようなコメントでも構いません。よろしくお願いします。
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