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(無題) 削除/引用 No.7709-6 - 2019/02/22 (金) 12:10:42 - abc 皆様丁寧に教えて頂きありがとうございます！ 時短することも考えながら各操作を見直してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.7709-5 - 2019/02/21 (木) 11:34:25 - おお mozさんの指摘に加えてmozさんの指摘に加えて Niカラム吸着後、かるくWashしてO/N。またはWashを低速にして（FPLCとかでせっていできるなら）O/N（Washのバッファーの量は２、３倍多くてもいいしWashが終わったところで止まるようにしておいてもいい。まあ枯れない事が前提）。FPCLならElutionのプログラムをスタートして帰宅。 透析O/N。 菌で凍結するにしろ、Lysatesを凍結するにしろ、どのステップに関しても蛋白によっては、しないほうがいいというものもあるので万能とはいえない。 まあ要領を得ると一日で終わらなくもないと思う（透析がちょっと時間食うのでそのへんをどう工夫するかだけど）。

(無題) 削除/引用 No.7709-4 - 2019/02/21 (木) 10:58:36 - RG 破砕液を保存するのはプロテアーゼなどの不純物と共存することになるのでおすすめしません． またアフィニティ後の溶出液はイミダゾールやpHの影響を受けやすいタンパク質の場合は溶媒置換（4℃で一晩透析、限外ろ過、ゲルろ過）する必要があります．

酵素抽出・精製工程にかかる時間について 削除/引用 No.7709-3 - 2019/02/21 (木) 10:55:32 - RG 5年間ほどタンパク質の結晶化に携わっているものです． 培養液の量にもよりますが，回収破砕、アフィニティ（ステップワイズが早い）、溶媒置換（ゲルろ過なら数十分）なら6時間もあれば終わるかとおもいます。 リコンビナントタンパクをすぐに使わないときは菌体を-80℃で保存する手もありです．ただし長期間保存すると不溶画分への割合が多くなるようなイメージがあります． どちらにせよ各工程を短縮（楽に早く）できるように考えた方がよいです

(無題) 削除/引用 No.7709-2 - 2019/02/21 (木) 10:49:54 - moz 酵素の性質やタンパク分解酵素に対する耐性に影響されますが、中断できそうな操作は、 大腸菌を回収後＞-80℃保存 超音波破砕して酵素を抽出後＞4℃、-20℃、-80℃保存 Hisタグカラムで精製＞溶出液を4℃、-20℃、-80℃保存 凍結操作を行うと不純物や目的物が沈殿する場合があるので注意が必要です。凍結時にグリセロールを10~50%添加すると沈殿防止や活性低下に効果的なこともあります。

酵素抽出・精製工程にかかる時間について 削除/引用 No.7709-1 - 2019/02/21 (木) 10:37:47 - abc 培養した組換え大腸菌を回収し、超音波破砕して酵素を抽出、Hisタグカラムで精製後、バッファー置換して酵素溶液を作製する実験を〜11時間くらいかけて行っています。 大学でこのような操作を教えて頂いたため、これを会社で実施していきたいのですが、勤務時間の問題があり、現在のタイムスケジュールで実験するのは現実的ではありません。 できれば、今一日で行っている操作を二日などに分けられればと思っているのですが、上記の工程のうち、一旦止められる工程などはあるのでしょうか？ これまで殆どこういった実験を実施したことがなく、皆様がどうやって抽出・精製のタイムスケジュールを組んでいるかを教えて頂きたいです。 よろしくお願い致します。

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