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(無題) 削除/引用 No.7692-7 - 2019/02/18 (月) 05:15:16 - Mac 挿入部位不明のトランスジェニックの場合は、ゲノムのqPCRでホモの見当をつけ、野生型マウスと掛け合わせた時の子供の遺伝子型で確認（ホモであれば、子供はヘテロのみになる）した事があります。トピ主さんのケースであれば、mRNAが検出可能なマウスのうち、発現の低いものから見当をつけて、KOと交配して子供の遺伝子型を見れば、判別可能かもしれません（ヘテロであれば、子供の半分はKO、野生型であれば子供はヘテロのみ）。 ただ、皆さんおっしゃっているように、KOであればゲノムの情報がそろっているわけで、ゲノムDNAのPCRで普通にやれば良いように思うのですが、何か訳ありなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7692-6 - 2019/02/15 (金) 14:06:08 - おお 遺伝子発現にフィードバックがかかっていたら必ずしもヘテロだから半分にはならない。取ってきた組織はたいていいろいろな種類の細胞が混在しているだろうし、目的の遺伝子の発現レベルがもともと高い種類の細胞がマウス間で変わればもっと分けのわからないことになるし。 RNA扱わないといけないので手間もかかる。

(無題) 削除/引用 No.7692-5 - 2019/02/15 (金) 13:59:05 - み mRNAや蛋白レベルでWTとHTを見分けられるかどうかはテクニカルな部分が大きく影響するだろうしKO作製時のストラテジーにも依存する。 問題となっている遺伝子がマイナーな細胞でしか発現していなかったり、HT, KOされることで発現細胞の発生や生死に影響を及ぼす場合は単純にWT vs. HTが2:1にはならないかも。 特にmRNAはWTよりHTの方が多く発現する場合だってある。 qPCRも１サイクルの違いが２倍とカウントされる検出系だし。 単純にgenome DNAでのPCR genotypingで駄目な理由があるのかなあ。

(無題) 削除/引用 No.7692-4 - 2019/02/15 (金) 13:29:35 - AP KOといってもいろいろなアレルがありうるわけで。 プロモーターが完全に潰れているのでなければ、あるいは転写領域が全く欠失しているのでなければ、プライマーの設定位置によってはKOアレルからの転写産物を検出してしまう可能性は大いにあります。NMDでRNAが早く分解されるかもしれない、といっても個々のケースでどの程度かなんて未知ですし、確実に欠失している領域にプライマーを設計し直すとしたら、系を立て直す必要があるでしょう。 good ideaじゃなさそう。

(無題) 削除/引用 No.7692-3 - 2019/02/15 (金) 12:56:42 - gDNA mRNA（正確にはｍRNAから作ったcDNAか）の発現量を比べれば+/-と+/+の区別がつくだろうか？が質問の趣旨だと思います。DNAが二倍あるからmRNAも二倍となるとは限らず、臓器、細胞によっては差がもっと小さい場合もある（1.4倍とか）。そして、マウスの個体差による発現量の差がその差を越える場合もあったりする。以上を考えると、安定して発現量の違いからジェノタイピングが出来るような条件（もしあればだが）を見つけるためには結構な予備実験が必要になる可能性が高いので、そんなことに時間を割く位なら、素直にプライマーデザインしてゲノムDNAに対してPCRをかける系を作るほうがよっぽど簡単だと思う。 ところで、 これからマウスを作ります、ラボでは既に対象遺伝子の発現量に対するqPCRの系がまわっているので、これを使ってジェノタイピングを行えるでしょうか？という質問ならわかる。 だが、既にマウスは維持しています、ならラボにはジェノタイピングする為のシステムがあってしかるべきだと思うのだが、それが無く、qPCRでジェノタイピングできますか？ってどういうシチュエーションなのでしょうか？ちょっと好奇心から聞いてみたいです。

(無題) 削除/引用 No.7692-2 - 2019/02/15 (金) 11:11:45 - NNN ゲノムでやればいいのでは？

qPCRを用いてのKO、ヘテロKOの判別 削除/引用 No.7692-1 - 2019/02/15 (金) 10:51:41 - kukur ある分子をKOしたマウスをホモ(-/-)で維持しています。 今後の実験を考えて、いずれはWTとかけてヘテロKO(+/-)を作出し、そのヘテロ同士(+/-)を掛けて同腹子(+/+, +/-, -/-)での実験を行おうと思います。 ふと思ったのですが、ヘテロKO同士からの子供のうち、+/-と+/+を判別するにあたっては通常、遺伝子上から切り取られた部分の配列を含む領域のプライマーを設計し、ジェノタイピングを行うと思いますが、対象となる分子のqPCRを行い、+/-と+/+のmRNAの発現量を比べれば、どちらがどちらであるか相対的な判別が可能ではないかと思ったのですが、いかがでしょうか。 それとも、遺伝的には+/+:+/-:-/-=1:2:1でも確実に両方の遺伝子型の個体が生まれてくるとは限らないから、相対的な評価ができない場合は難しいのでしょうか。 （標的遺伝子のqPCRの系は所属ラボで既に動いているので、取り急ぎのcheckにはそちらの方がすぐ行えるので聞いてみました）

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