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(無題) 削除/引用 No.7689-11 - 2019/02/19 (火) 03:28:44 - おお https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/rna-isolation/general-articles/rna-yields-from-tissues-and-cells.html 確かに脂肪組織ではその組織量ではかなり微量になりそうですね。。。

(無題) 削除/引用 No.7689-10 - 2019/02/18 (月) 12:27:16 - DKP AP様 ありがとうございます。 カラムではなく、Trizolを用いて抽出し吸光度を測らずに逆転写させPCRにかけてみたところターゲットと内在性遺伝子の増幅が確認できました。 教えていただいたようにTrizolで抽出した後カラムを用いて再精製する方法も検討してみようと考えております。

(無題) 削除/引用 No.7689-9 - 2019/02/18 (月) 11:01:47 - DKP おお様 PCRにまわせる脂肪組織は5 mg程度です。

(無題) 削除/引用 No.7689-8 - 2019/02/18 (月) 10:59:07 - DKP asan様 ありがとうございます。 Tirolを用いてRNAを抽出し吸光度は測定せずに全量を逆転写してみました。また、添加するTrizolの量の検討も行ったところ、Trizol量によってRNAの収率が異なることも分かりました。

RT-PCRでRNA量が足りない時の対処法 削除/引用 No.7689-7 - 2019/02/18 (月) 10:44:34 - DKP ***様　 ありがとうございます。 キットを使わず、Trizolを用いた抽出方法でRNAを沈殿させ逆転写しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.7689-6 - 2019/02/15 (金) 02:03:35 - おお RNA精製にまわす組織の量（重量とか）はどれくらいですか？

(無題) 削除/引用 No.7689-5 - 2019/02/14 (木) 20:02:05 - AP わかんないけど、 >RNAの抽出にはFast Gene RNA Premium Kit(NIPPON Genetics Co,Ltd)を用いて抽出しています。 としか書いてないから、脂肪組織用になにか工夫したということはなさそうですね。油だらけのホモジネートをそのままカラムにかけてるんじゃないですか？　だったらうまくいきそうにない。

(無題) 削除/引用 No.7689-4 - 2019/02/14 (木) 19:59:16 - AP 別に吸光度測定は必須じゃないさ。だって結局、qPCRで定量するんだもの。 今の時代、one cellからでもreal-time RT-PCRするんだから、量が少ないとか吸光度が測れないとかで泣きを入れることないです。量不明のまま盲撃ちでRTかけたっていい。 脂肪組織は脂肪が多いだけにちょっと材料としては特殊。 それ用のキットや改変法があると思う。 まあ、カラム式じゃなくてAGPC法、Trizolとか改良法のIsogen IIなんかで精製するほうがいいと思います。脂肪組織向けのテクニカルチップ（脂質層をよけて水層を取るとか）や、ひょっとしたらそれ用のキットもあるかもしれない。 どうしてもシリカカラムで仕上げたければ、一旦AGPCで精製したRNAを再精製すればいい。

(無題) 削除/引用 No.7689-3 - 2019/02/14 (木) 19:35:16 - asan カラム系のキットを使う場合は溶出ボリュームが必要なのでどうしても薄いサンプルには向かない場合もあります。 TrizolやIsogenなどのフェノール系の抽出の場合はRNAを含む水相をイソプロ沈殿する過程で共沈材（takaraなどで販売してる）を利用して全量回収してRT-PCRかければ普通に問題なく結果は出ることが多いです。ただし、mRNAの発現量によっては検出感度以下になる場合はあるかもしれませんが、FACSで数千から数万の細胞数のfrでもsingle cell RNAseqでもこの方法は使われる場合もあるぐらいなので原理的には上手くいくはずです。 脂肪細胞は脂質成分が多いのでそれによって回収しづらいことがあるとのことなので場合によってはTrizolなどの量を増やした方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7689-2 - 2019/02/14 (木) 19:32:33 - *** 何かしら沈殿させて定量せず全量逆転写してはいかがでしょうか。

RT-PCRでRNA量が足りない時の対処法 削除/引用 No.7689-1 - 2019/02/14 (木) 19:01:14 - DKP いつも大変お世話になっております RT-PCRとウエスタンブロッティングで白色脂肪組織について検証しようと考えています。 RNAの抽出にはFast Gene RNA Premium Kit(NIPPON Genetics Co,Ltd)を用いて抽出しています。 キットに細かい原理など記載がないのですが、おそらくグアニジンチオシアン酸で抽出しているのだと思います。 RT-PCRでは組織から抽出したRNA量が少なく、吸光度が測定できません。 脂肪組織は他のアッセイにも使うため、抽出する組織量を増やすことはできません。 RNA量が少ない時の対処法をご教授のほどよろしくお願い致します。

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