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hemiでdeletionが起こっているかどうかの見分け方 トピック削除
No.7685-TOPIC - 2019/02/13 (水) 22:21:00 - ばつ丸
お世話になります。

ある遺伝子にdeletionが起こっていると公共データベースに載っている細胞株で実験を行っているのですが、その遺伝子上で5'末付近から3'末付近まで領域を変えて3つのTaqMan probeでqPCRを行ったところ、3領域とも検出されました。野生型と比べてもCt値が低いということはないのでノンスペとは考えておりません。

そこで
@hemizygous deletionが起こっている
Aデータベースが間違っていて本当は野生型
B3つのTaqMan probe間のどこかで短めのdeletionが起こっている
の3つの可能性を考えているのですが、Bは普通にシーケンスを読めばいいとして@とAに関してNGS以外でこの2つを見分ける方法はございますでしょうか。

deletionが起こっている領域が分かっていればその前からシーケンスを読むなり、その領域を挟む形でプライマーを設計してPCRをかけるなりやりようはあると思うのですが、いかんせん欠失領域やその長さが分からないのでプライマーの組みようがなく、困っております。何かしら方法をご存知でしたら教えていただければと思います。よろしくお願いいたします。
　
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No.7685-6 - 2019/02/15 (金) 13:05:31 - ばつ丸
>おおさん
qPCRは単純にその領域が検出されるかどうかを検討しました。欠損している根拠については載っておらず分からなさそうです・・・。サザンブロットは未経験ですが検討してみたいと思います。ありがとうございます。

>APさん
当初はhemizygousかhomozygous deletionを期待して（というかそうだと思い込んでいて）実験を行ったのですが、後から冷静に考えるとheterozygousなのかもと思った次第です。今もなおhemizygousの可能性はあると思っております。実験の目的から必ずしもホモの欠損体である必要はなく、hemiや領域によってはheteroでも意味がある一方、hemiなのかhomoなのかで結果の解釈は大きく変わりかねないので質問いたしました。アドバイスをいただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.7685-5 - 2019/02/14 (木) 14:09:03 - AP
>@hemizygous deletionが起こっている
>Aデータベースが間違っていて本当は野生型

これはらどちらにしても野性型のアリルが存在するわけで、遺伝子の欠損体としては使えないわけでしょう？　
欠失アリルが存在するかどうかじゃなくて、野性型アリルが存在するかどうかなら確認の仕様があると思うけれど。（全長のPCR, シークエンスなど）。
いずれにせよ鶏を牛刀でさばくにたいなもので、NGS案件ではないでしょう

あと、ネズミやってる人で、よくそう言い張る人がいるんだけれど、その状態を指す遺伝学用語は正しくはhemizygousではなくてheterozygousです。染色体の大きな欠失や染色体自体が失われて、当該の遺伝子座全体が完全に失われていて、相同遺伝子対がない状態がhemizygousです。

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No.7685-4 - 2019/02/14 (木) 13:54:03 - AP
Southern blot
hetero allelicでも一目瞭然。

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No.7685-3 - 2019/02/14 (木) 03:47:50 - おお
まあ色々とやり方はあるだろうけどmRNAなどからはなにか情報がないですか？

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No.7685-2 - 2019/02/14 (木) 02:07:54 - おお
qPCRでヘテロのばあいCt値が１変わるのを検出しようとしているという事ですか？

いずれにしろ、ある程度の長さがDeletionしているならサザンブロットは有効な手段だと思います。

Deletionが短いものでその遺伝子のごく一部の領域にあることはないですか？

データーベースで欠損していると示されているそうですが欠損している根拠はなんですか？

hemiでdeletionが起こっているかどうかの見分け方 削除/引用
No.7685-1 - 2019/02/13 (水) 22:21:00 - ばつ丸
お世話になります。

ある遺伝子にdeletionが起こっていると公共データベースに載っている細胞株で実験を行っているのですが、その遺伝子上で5'末付近から3'末付近まで領域を変えて3つのTaqMan probeでqPCRを行ったところ、3領域とも検出されました。野生型と比べてもCt値が低いということはないのでノンスペとは考えておりません。

そこで
@hemizygous deletionが起こっている
Aデータベースが間違っていて本当は野生型
B3つのTaqMan probe間のどこかで短めのdeletionが起こっている
の3つの可能性を考えているのですが、Bは普通にシーケンスを読めばいいとして@とAに関してNGS以外でこの2つを見分ける方法はございますでしょうか。

deletionが起こっている領域が分かっていればその前からシーケンスを読むなり、その領域を挟む形でプライマーを設計してPCRをかけるなりやりようはあると思うのですが、いかんせん欠失領域やその長さが分からないのでプライマーの組みようがなく、困っております。何かしら方法をご存知でしたら教えていただければと思います。よろしくお願いいたします。
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