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(無題) 削除/引用 No.7680-8 - 2019/02/20 (水) 03:41:51 - 真夜中の貴公子 聞いておいたにもかかわらず、返事が遅れてすみません。 Macさん、 CFSEで見ています。それと、IntraでTh1とTc1 generationをアウトプットとしています。 培養前のBMDMはCD80, CD86, MHCIIはそれほど高くなく、抗原パルス後にはそれらは大きく上がっていました。T細胞との培養後のステータスは見ていません。そもそも細胞が死んだかで少なくなっていて回収できませんでした。 私の系ではサイトカイン無しでBMDMはco-cultureで24hくらいが生存限度のようです。つまりは不安定な系のようなので、用途は限られそうです。抗原パルス後にPFAでFixしてT cellに抗原提示させているプロトコールもあるので、そういう用途ならOKかもしれません。 ぺんぺんさん、 Peri-Macを使った方が安定している気がします。採取した後、activation statusなど細かくはチェックしていませんが、BMDMよりT細胞への抗原提示能は強いようです。一応WTとKOで差が出ました。 みなさんありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7680-7 - 2019/02/13 (水) 06:14:54 - Mac BMDMの調整はどのようにされてますか？　サイトカインなしだと厳しいですよね。「へたっている」というのがどのような状態なのか分かりませんが、MHC class IIやCD86の発現は見てありますか？ マクロファージでの抗原提示実験の経験はないので、見当はずれかもしれませんが、昔の論文（下記）など見ると、M1やM2b（今はもうこういう言い方はしないかもしれませんが）にpolarizeしないとclass IIの細胞表面発現が低いようです。 ご参考まで：ttps://jlb.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1189/jlb.0406249 あと、プロトコールの５番を見ると、共培養したT細胞の増殖は見られるようですが、CFSEではどうでしょう？　Th1/Th2で見る場合は、BMDMのpolarizationの影響は考慮すべきかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.7680-6 - 2019/02/13 (水) 05:01:34 - ぺんぺん 腹腔内マクロファージは試してみてもいいかもですね。 ソースが異なるとMHC2や副刺激分子も違うでしょうし。 M2にポラライズしてるのでしたら、ブロック抗体などを使ってもいけるのかもですね。 すみません、自信はありません。 アメリカなのですね。私もです。がんばりましょうね。

(無題) 削除/引用 No.7680-5 - 2019/02/13 (水) 03:39:41 - 真夜中の貴公子 おおさん、 ありがとうございます。 一応そういった論文やresearch gate を参考にしてみましたが、結構パルス後にPFA固定して抗原提示にもっていっているプロトコールが多く、そうなると生きた細胞を使う意義がなくなると思っていました。 そもそもマクロファージを長期間生かしておくのが難しいので、固定してMHCのみ機能させようということなのでしょうけど、、、そうなると、別にマクロファージじゃなくて、抗原＋テトラマーとかで十分なんではないでしょうか。そして、更には、こういう系ではマクロファージ自体の抗原提示のについて何かいえるものではなくなると思います。 この観点から、マクロファージの抗原提示に対する機能を見たい私は、固定はせず、生かしたままco-cultureしてみましたが、どうもマクロファージがへたっているように思えます。 昨夜対策を考えてみましたが、マクロファージ：Tの比率を変えてみる、とか、培養時間を短くするとか、BMDMではなくPeritoneal macrophageを使うとかしか思いつきませんでした。できればサイトカインは使いたくないです。 何かアイデアがあれば教えていただけますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7680-4 - 2019/02/13 (水) 03:32:44 - 真夜中の貴公子 コメントいただきありがとうございます。 私はDC専門でやってきたので、マクロファージの抗原提示能については同感です。 実はとても困っている状況です。 今のラボで、ミエロイド系細胞のプロモーターでドライブされる遺伝子のTgマウスで、マクロファージがT細胞を強くアクティベーとするという論文が既に出されており、そのストーリーに沿ってマクロファージベースの研究が動いています。私は、背景にはDCがあると疑っているのですが、既に論文になっている分、明確なデータが出せないうちはマクロファージ説を否定できません。ちなみに、ラボのバックグラウンドは免疫ではありませんので、スクリーニング段階でDCとマクロファージで誤解があると思っています。彼らはDCの解析になぜかCD11ｂ/CD11cのみ使っており、MHCIIは見ていません。この場合、本当に抗原提示能のあるDCは引っかかってきません。 これがアメリカの一流と言われているラボなので、私の理解がおかしいのか、スキルが悪いのか、とても困っています。 今のところどうしてもマクロファージでco-cultureしないといけない雰囲気ですので、何か良い策やプロトコールをご存知でしたら教えていただけますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7680-3 - 2019/02/13 (水) 03:29:08 - おお マクロファージとT細胞を使った参考にした文献とかありますか？

(無題) 削除/引用 No.7680-2 - 2019/02/12 (火) 15:15:04 - ぺんぺん DCに比べてmacrophageの抗原提示能は低いはずです。 ほとんどペーパーではDCではないですか？ あまりしないと私は思います。

マクロファージとT細胞の共培養 削除/引用 No.7680-1 - 2019/02/12 (火) 15:01:32 - 真夜中の貴公子 マクロファージとT細胞の共培養 (Antigen presentation assay)がうまくいかず困っています。 ちなみに、樹状細胞とT細胞の共培養は過去に経験があり、それを元に各プロトコールをモディファイしています。 どういうわけか、培養時間を長くするとT細胞の増殖が落ちるように見えます。サイトカインポジティブ細胞が検出できません。過去に樹状細胞で行った際は、３日くらいは平気でどんどん増えていました。 マクロファージがへたってきたとかでしょうか。 プロトコールは、 1. BMDMを調整し、OVA 100ug/mLで一晩パルス 2. OVAで免疫した（8-12日）マウスの脾臓とリンパ節よりT細胞をソート 3. マクロファージ：T=1:5でMix 4. 37℃でインキュベート 5. 増殖したら（コロニー形成が見られる）回収 6. Re-stimulation last 6h(anti-CD3/CD28),proteintransport inhibition last 2h 7. 細胞内染色でサイトカイン産生を解析(Th1, Th2) です。 今のところ、マクロファージ自体のコンディションの問題、Re-stimulationの係り具合の悪さなどを疑っています。24, 48, 72時間どこで見ても、サイトカインポジティブのT細胞が1−2％です。樹状細胞の場合、OVA刺激ではもっとドカンと出ていました。 マクロファージを使ったT細胞への抗原提示の経験がある方、アドバイスをお願いできますでしょうか。

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