Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

フローサイトの機種により感度が異なる件について。 トピック削除
No.7668-TOPIC - 2019/02/08 (金) 06:19:54 - フロー
お世話になります。

私は細胞株をある抗原に対する抗体、またはFc融合の組替えタンパク質で染めてフローサイトメトリーを行なっています。

ルーチンで用いる機種は、FACSCaliburです。
蛍光はAlexaFuor488またはPEを用いています。

抗体とFc融合の組替えタンパク質で染めたパターンは完全に一致しています。（認識抗原は一緒のため）

この度、細胞株をFc融合の組替えタンパク質で染色し、陽性と陰性の分画にソートしたいです。ソート前は各5割ほど存在しています。

そこで、ソーティング機能のあるMoFloでソートしようとしたところ、FACSCaliburで見えていた明確な陽性陰性集団が見えず、すべて陰性になっていました。
MoFloの操作は卓越した技官さんが行ってくださっています。

技官さんにおかしい旨を伝え、すぐにそのサンプルを同室にあるFACS LSR-IIで解析したところ、FACSCaliburで見た5割ずつの陽性陰性集団が綺麗に分離していました。

以上のことから、染色がうまくいっており、FACSCaliburでもFACS LSR-IIでも陽性陰性集団は明確に分離できていると考えています。

一方、MoFLoでは明確な差が認められず、驚いたことに感度が高いPEを使ったとしても全く分離が認められませんでした。

なぞなのが、抗体で同じ抗原をその細胞で染めた際にはMoFloで分離が認められます。（AlexaFuor488であってもPEであっても）

ただ、組替えタンパク質で染めるとMoFloでは見えなくなります。

同室にFACS AriaIIIもありますが、そのソーターは使ったことがありません。

質問は、抗体ではなくFc融合タンパク質で細胞を染めるとKd値や相互作用のパラメータ次第で機器によって結合が見えなくなるなんてことはあるのでしょうか？

抗体、Fc組替えタンパク質いずれもMFI（平均蛍光強度）はFACSCaliburでもFACS LSR-IIでも同じくらいです。

どうにかそのFc組替えタンパク質でソートしたいです。
どうかアドバイスやコメントをいただけませんでしょうか？よろしくおねがいします。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.7668-5 - 2019/02/10 (日) 09:15:23 - asan
＞機器によって結果が異なるというのは考えたらわかるような、けどそれで本当にいいの？とも思います。

レーザーも消耗品ですから、ずっと使ってれば当然へたってきますよ。
また、同じ傾向淡白質を見るのでもどの種類のレーザーをあてがって励起して、どのディテクターで検出してるかは機種によっても、選択するディテクターとレーザーの組み合わせによっても違います。十分に利用できる範囲で使用するのが前提ではありますが、それでもピークに近いレーザーと検出器が使用できた方が絶対的な感度は強めに出るでしょう。ちなみにCaliborとその後の機械は設計からしてレーザーやフィルターの組み合わせが大きく違います。ま、普通は後継機の方が強いと思いますけど。

S/N比で十分分離できてないのかどうかわかりませんが、確かな差があるならどっちかのセッティングがおかしい可能性とかはないですかね？PEに近い別のフィルターで見たりしても同じなんでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.7668-4 - 2019/02/10 (日) 05:14:01 - フロー
TK-1さん、DCさん、

返信が遅くなりすみません。

そうだったのですね。知りませんでした。
機器によって結果が異なるというのは考えたらわかるような、けどそれで本当にいいの？とも思います。
一度アリアで行ってみます。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.7668-3 - 2019/02/09 (土) 09:36:42 - DC
経験あります。

BDのマシンは好き嫌いはあれど、セッティングだけしっかりされていれば、最も信頼性が高いので、そのシグナルは当然信用できます。
また、BDで得たシグナルは他のBDではほぼ再現できると思っています。
ですが、他社のマシンはそうはいきませんでした。

という点から考えて、私としてはAriaをお勧めします。Ariaでだめなら他はもっとだめと勝手に決め付けいていますが。

(無題) 削除/引用
No.7668-2 - 2019/02/08 (金) 07:07:22 - TK-1
Laserの出力やdetectorが違えば同然感度は変わるし、MoflowはFlow cellじゃなくてjet-in-airですから。Ariaでやれば見れるんじゃないですか。

あと、抗体とFc-fusionでも感度が変わって当然じゃないですか

フローサイトの機種により感度が異なる件について。 削除/引用
No.7668-1 - 2019/02/08 (金) 06:19:54 - フロー
お世話になります。

私は細胞株をある抗原に対する抗体、またはFc融合の組替えタンパク質で染めてフローサイトメトリーを行なっています。

ルーチンで用いる機種は、FACSCaliburです。
蛍光はAlexaFuor488またはPEを用いています。

抗体とFc融合の組替えタンパク質で染めたパターンは完全に一致しています。（認識抗原は一緒のため）

この度、細胞株をFc融合の組替えタンパク質で染色し、陽性と陰性の分画にソートしたいです。ソート前は各5割ほど存在しています。

そこで、ソーティング機能のあるMoFloでソートしようとしたところ、FACSCaliburで見えていた明確な陽性陰性集団が見えず、すべて陰性になっていました。
MoFloの操作は卓越した技官さんが行ってくださっています。

技官さんにおかしい旨を伝え、すぐにそのサンプルを同室にあるFACS LSR-IIで解析したところ、FACSCaliburで見た5割ずつの陽性陰性集団が綺麗に分離していました。

以上のことから、染色がうまくいっており、FACSCaliburでもFACS LSR-IIでも陽性陰性集団は明確に分離できていると考えています。

一方、MoFLoでは明確な差が認められず、驚いたことに感度が高いPEを使ったとしても全く分離が認められませんでした。

なぞなのが、抗体で同じ抗原をその細胞で染めた際にはMoFloで分離が認められます。（AlexaFuor488であってもPEであっても）

ただ、組替えタンパク質で染めるとMoFloでは見えなくなります。

同室にFACS AriaIIIもありますが、そのソーターは使ったことがありません。

質問は、抗体ではなくFc融合タンパク質で細胞を染めるとKd値や相互作用のパラメータ次第で機器によって結合が見えなくなるなんてことはあるのでしょうか？

抗体、Fc組替えタンパク質いずれもMFI（平均蛍光強度）はFACSCaliburでもFACS LSR-IIでも同じくらいです。

どうにかそのFc組替えタンパク質でソートしたいです。
どうかアドバイスやコメントをいただけませんでしょうか？よろしくおねがいします。
全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。