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(無題) 削除/引用 No.7650-6 - 2019/02/05 (火) 10:26:54 - おお あ、そうそうもう一つ言いたかったことは１）の可能性を考えるなら具体的にどのプラスミドを使っているか明示できればそれを使っている方々の経験を聞くことができるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.7650-5 - 2019/02/05 (火) 09:39:49 - おお ４つの異なる遺伝子で同じ事が起こっているなら考えられることが絞れてきます。 １）Vector プラスミド自身が大腸菌の増殖を抑制する可能性 ２）実験の過程で何らかの不適切な要因がある可能性（たまたま使った培地がへんだったとか） １）のばあい、極端に増えが悪い場合はRecombinationなどが起こったプラスミドがドミナントになりやすいので、大腸菌を変えたほうが良い場合が多いでしょう。ただRecombinationしたプラスミドがドミナントになった場合大腸菌の増殖にネガティブな要素が取り除かれているだろうから、増殖がと途中で激変するとかないならそれでもプラスミドはとれる可能性はたかい。わざと低温、低濃度抗生物質でコピー数を減らして培養するというオプションもある。Vector プラスミドでは大腸菌の増殖が遅いとかない場合、４つの違ったインサート全部で増殖抑制されるという事は、かなり可能性として低いと思うので２）の可能性を疑うほうがいいように思います。 ちゃんと増えるプラスミドにおいてアンプの量が２倍程度になってもそんなに明らかな大腸菌の増殖の違いが認識できるほどになるとは思えません。ただしRecombinationなどを起こしやすいものであれば、変なプラスミドが発生する機会が増える可能性が高くなります。

(無題) 削除/引用 No.7650-4 - 2019/02/05 (火) 09:17:58 - asan 寒天培地でコロニーとっても増殖が遅いのでしょうか？ 24時間でほとんど増えないというのは、大抵の場合増やしたい大腸菌以外のものが増えてきてる可能性が高いと思います。 DH5aはJM109とかに比べると明らかに増殖は遅いですが、普通にクローニングに使うのでそれで問題になることは普通はないと思います。 シェイカーが止まってたとかでエアレーションが悪かった、Amp耐性菌が増えてきてた、プラスミドが実はkanRだった色々な理由で変なものが増えてる可能性はないですかね？

(無題) 削除/引用 No.7650-3 - 2019/02/05 (火) 05:23:30 - ぺんぺん ベクター内に繰り返し配列を含むなら、それをアボイドするための大腸菌というのがあります。指摘されてるneb stableはおそらくそういうものでしょう。 DH5アルファでも増えるとは思いますが、だからといって組み換えが起きていないとは言い切れないので、気を付けた方がいいかも。

(無題) 削除/引用 No.7650-2 - 2019/02/05 (火) 02:21:16 - おお DH5アルファでも大抵プラスミドを増やせますけど、、、 あまりにも遅いなら大腸菌じゃなくイースト類を増やしている可能性がありますけど、、、

大腸菌コロニーからミニプレップで増殖が遅い 削除/引用 No.7650-1 - 2019/02/04 (月) 23:19:44 - 大腸菌 お世話になります。 レンチウイルスベクターをアドジーンより購入し、そこへ4種類の遺伝子をクローニングし、コロニーPCRで陽性のものをピックアップして2ml LBで培養を開始しました。ですが24時間掛けてもぼんやりと濁るくらいです。 plateから液体培地に変わる際、アンピシリン濃度は誤って倍にしてしまいましたが、このプラスミドでは初めてですが、他にルーチンにクローニングする際にはこれで全く問題ありません。アドジーンによるとハイコピープラスミドのようです。 LB plate: Amp 50 ug/ml LB liquid: Amp 100 ug/ml 大腸菌はDH5アルファを使用しています。 ただアドジーンはNEB Stableを使用するように推奨しています。 レンチやレトロ用の大腸菌は持ってはいますが、やはりそれで形質転換するべきだったでしょうか...？ ご教示頂けますと幸いです。

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