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(無題) 削除/引用 No.7645-12 - 2019/02/06 (水) 07:51:18 - ぺんぺん ぺんぺんです。 プライマリは癖があると思うので、頑張ってくださいね。

(無題) 削除/引用 No.7645-11 - 2019/02/05 (火) 23:09:46 - がくちぇい ぺんぺん様 ありがとうございます。エレポ試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.7645-10 - 2019/02/05 (火) 08:09:00 - ぺんぺん 私はLCL（EBウイルスで不死化したB細胞）へはルーチンにエレポしてます。いい感じです。 さて。骨髄系白血病細胞なのですね。何系の細胞が腫瘍かしたかはわからないのでしょうかね。 それが私の先の質問でした。 細胞によってはプロモータがワークせず、全く発現しなかったこともあります。 エレポがワークしたらいいですね。その場合にはポジコンも忘れずに。 VSVGを使ったウイルスは超遠心で濃縮もできますね。

(無題) 削除/引用 No.7645-9 - 2019/02/05 (火) 06:32:07 - がくちぇい ぺんぺん様 細胞は骨髄系白血病細胞になります。現在使っているベクターでトランスフェクション、トランスダクションを考える場合、他に考慮したよいものはありますか？ 例えば、リポフェクションではなくて、エレポにするなど。 おお様のご指摘の通りにダイレクトにトランスフェクションすることも検討しております。

(無題) 削除/引用 No.7645-8 - 2019/02/05 (火) 06:19:15 - ぺんぺん ご自身で樹立されたのですね。 となると経験論はあてにならないかもしれませんね。 どういった細胞かわかりますでしょうか？ たとえばモノサイティックな細胞だとか、TやBなど。 VSVGを試してもいいかも。パントロピックですし。

(無題) 削除/引用 No.7645-7 - 2019/02/04 (月) 22:33:12 - がくちぇい ぺんぺん様 情報が少なくて申し訳ありませんでした。 プロモーターはEFSプロモーターで、ウィルスはlentiです。 Vsvgは使ってません… おお様 ご指摘の通り、タイターが低いというのはごもっともだと思います。 私もなんとかあげようと努力していますが、なかなか力不足であまりタイターが上がらないのが現状です。おっしゃる通り、タイターを上げれば私の標的細胞にも感染してくれるのかという期待もあるのですが、NIH3T3では３割程度は感染するのに、自作の細胞株ではまったく感染しないので、何か他に原因がないか皆様にお知恵をお借りしたいと考えていました。 ちなみに自作の浮遊細胞はマウス由来の白血病細胞です。 現状でプラスミドを直接この浮遊細胞にトランスフェクションすることもやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.7645-6 - 2019/02/04 (月) 06:55:31 - ぺんぺん ＞0％はGFPによる見積もりで必ずしもぜんぜん感染していないというわけでもないので、タイターをあげて意味がないとまではいえないと思いますが。 GFPがco-expressionされる実験系だと思われるので、GFPの指標で感染が全く認められない、と考えても差し支えないと思いますが、実際はどういう実験デザインなのでしょうか。もう少し情報を出してもらえるといいかと思います。 ぺんぺんからは以上です。

(無題) 削除/引用 No.7645-5 - 2019/02/04 (月) 04:20:53 - おお >なので、NIHで30％のものを100％にする工夫が徒労だとはいいませんが、それで浮遊細胞で0％だったものが感染するようになる、というのは考え難いかなという気がします。 0％はGFPによる見積もりで必ずしもぜんぜん感染していないというわけでもないので、タイターをあげて意味がないとまではいえないと思いますが。 どのような実験系を組みたいのか分かりませんけど、ウイルス製作用のプラスミドを直接その浮遊細胞にトランスフェクションしてみてもいいかもしれません。 その自作の浮遊細胞はどういうタイプの細胞でしょうか？種は何でしょうか？ウイルスのどのタイプでしょうか？ウイルスベクターも多岐にわたったものがあります。アデノ、レンチ、レトロなど。

(無題) 削除/引用 No.7645-4 - 2019/02/04 (月) 02:53:22 - ぺんぺん NIHで30％で、まぁ低いと言われればそうなのかもしれませんが、玄人ではない学生さんが行った実験なら、まぁまずまずの結果ではないでしょうか？ なので、NIHで30％のものを100％にする工夫が徒労だとはいいませんが、それで浮遊細胞で0％だったものが感染するようになる、というのは考え難いかなという気がします。

(無題) 削除/引用 No.7645-3 - 2019/02/03 (日) 10:58:07 - おお >NIH3T3などの既存の細胞株には同様に作成したウィルスで30%程度陽性細胞 ウイルスのタイターが低すぎるような気がするのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.7645-2 - 2019/02/03 (日) 08:02:09 - ぺんぺん ぺんぺんです。 プロモーターはなんですか？浮遊細胞(血球)ではワークしないものもあります。 ウイルスはれとろですか？レンチですか？ Vsvgをお使いですか？

CRISPRの浮遊細胞への導入について 削除/引用 No.7645-1 - 2019/02/03 (日) 07:32:59 - がくちぇい お世話になります。 初めてCRISPRを用いて実験を行っております。 CRISPRシステムを用いてある標的遺伝子をノックアウトさせようと考えております。 Lipofectamine3000でトランスフェクション後、ウィルスを回収し濃縮しました。 濃縮したウィルスをポリブレンを使って、自身で樹立した細胞株（浮遊細胞）にトランスダクションしましたが、全く導入されません（GFPで確認しました）。 NIH3T3などの既存の細胞株には同様に作成したウィルスで30%程度陽性細胞を認めております。 ポリブレンの濃度を振ったり、条件を変えて検討はしていますが、目的とした細胞株への導入がなされず、途方に暮れています。 アドバイスをいただければ幸いです。 宜しくお願いします。

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