全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.7618-17 - 2019/01/29 (火) 15:20:01 - AP 長期保存するときは小分けしてフリーズしておくといい。 古い版には記載がなかったが最新版には載っているようだ。昔から私らは自己流で実践してたんだが。

(無題) 削除/引用 No.7618-16 - 2019/01/29 (火) 14:54:39 - レベル２９のライチュウ >[Re:15] APさんは書きました : > 8-ハイドロキシキノリン　(8-HQ )、別名キノリノール > 酸化防止剤、ラジカルスカベンジャー。 > フェノールは酸化によってラジカルを生じ核酸を攻撃する。 > > あと2-MEを添加するレシピもあるけれど、臭さが増すのでおすすめしない。 Molecular colningに書いたことは次と同じです。 １．フェノールを６８度で液体に作ります。 ２．0.1％キノリノールを入ります。 ３．フェノールと同じ体積の0.5Mトリス(ｐH 8のTris-Cl)を入り、15分かき混ぜます。 ４．層が分離されたら、水層を吸入します。 ５．同じ体積の0.1Mトリス(ｐH 8のTris-Cl)を入り、15分かき混ぜます。 ６．フェノール層が >ｐH7.8になるときまで反復。 ７．水層を吸入し、0.2%β−Mercaptoethanolを入った0.1体積の0.1Mトリス(ｐH 8のTris-Cl)を追加します。このフェノール溶液は100mM Tris-Clの下で保管します。 7番のことは 「After the phenol is equilibrated and the final aqueous phase has been removed, add 0.1 volumn of 0.1M Tris-Cl(pH 8.0) containing 0.2% beta-mercaptoethanol. The phenol solution may be stored in this formn under 100mM Tris-Cl(pH 8.0) in a light-tight bottls at 4 degree for periods of up to 1 month.」 これが原文であります。

(無題) 削除/引用 No.7618-15 - 2019/01/29 (火) 14:32:21 - AP 8-ハイドロキシキノリン　(8-HQ )、別名キノリノール 酸化防止剤、ラジカルスカベンジャー。 フェノールは酸化によってラジカルを生じ核酸を攻撃する。 あと2-MEを添加するレシピもあるけれど、臭さが増すのでおすすめしない。

(無題) 削除/引用 No.7618-14 - 2019/01/29 (火) 14:11:58 - AP 水層のpHを確認してpH 8になっていれば、中間段階でどういうステップにしようと構いません。pHメーターで測るためのやりかた（バッファー層をとって水で何倍かに薄めればガラス電極のpHメーターが使えるとかなんとか）もあったと思いますが、pHペーパーを使うのが簡便です。

(無題) 削除/引用 No.7618-13 - 2019/01/29 (火) 14:07:01 - moz 中和PCIの作製に関しては、APに異論はないです。 中和したフェノールは酸化しやすい（=>DNAにダメージを与える）ことは覚えておきましょう。そのため、キノリノールだっけ？を酸化防止剤として加えることが多いです。 最近はクロロホルムの取り扱いがごく少量でも面倒になったので、処分して久しい。。。

(無題) 削除/引用 No.7618-12 - 2019/01/29 (火) 14:06:39 - レベル２９のライチュウ >[Re:9] APさんは書きました : > 最終産物の水相がTEになっているかTris bufferかの違いで作り方は変わりません。また、どっちを使ってもパフォーマンスに変わりありません。 > > 言うまでもないですが、バッファー飽和するのはpH 4ほどの酸性であるフェノールをpH 8程度の弱塩基性にするためでもあります。酸性条件下ではDNAは有機層に行ってしまいます。弱塩基性にしてリン酸基の電離度を高めることでDNAは水層に残ります。逆に酸性フェノールでDNAを除去しRNAを水層に回収するのがAGPC法。 > > TE飽和でも最初はTris bufferで飽和すべきです。 > Tris buff飽和ができたのち、水相をTEで置き換えます。 > 最初からTEだとTris濃度がうすすぎて、フェノールがTris飽和しにくくpHを8にするのに苦労します（バッファー交換の回数が増える）。 > Molecular Cloningで1 M, 0.5 Mと濃いTrisでやっているのもpHを早く8にするためです。一回目の平衡化をバッファーでない、ただの1 M トリス溶液（pH が高い）でやる変法もあります。 > > > 自作するときは、Molecular Cloningがそうだったと思いますが、最終的に0.1 M Tris (pH 8)が水層になるようにして完成ですが、市販品だとTEに置き換えているのが多いみたいですね。あんまり意味ないと思いますけど。 > > なお、フェノールを含水させて液化すると体積が倍近くなります。そのフェノールの体積に対して同体積のバッファーで処理しますから、それだけの体積になることを頭に置いておくように。 > 例えば500 mLビンに入ったフェノール（常温固体）に加水して液化しようとしたら、そのビンではあふれてしまいます。入れられるだけの少量の水を加えたらあとは50-60℃の温浴で液化し、大きなビンに移してから平衡化の作業をしなければなりません。あるいは温浴だけで融かして必要分だけ分けてから平衡化するとか。 そうだったら、0.5Mトリスｰ>0.1Mｰ>TEバッファー順序に、TEバッファー平衡化を追加し、平衡化自体をTEバッファーでし、0.5Mトリスｰ>TEバッファーに変わっても大丈夫ですか?

(無題) 削除/引用 No.7618-11 - 2019/01/29 (火) 14:04:56 - AP それはTrisの溶解度飽和 (solubility saturation)のこと。ここで話題にしているのはTrisバッファーの飽和。飽和の意味は溶解度飽和だけじゃない。saturationという語の意味を一部しか理解していないんじゃないか？

(無題) 削除/引用 No.7618-10 - 2019/01/29 (火) 14:00:11 - moz TrisでpH8に平衡化しても、Trisを加えていけばよりアルカリになります。 すなわち、Tris（の溶解度）は飽和に達していません。

(無題) 削除/引用 No.7618-9 - 2019/01/29 (火) 14:00:09 - AP 最終産物の水相がTEになっているかTris bufferかの違いで作り方は変わりません。また、どっちを使ってもパフォーマンスに変わりありません。 言うまでもないですが、バッファー飽和するのはpH 4ほどの酸性であるフェノールをpH 8程度の弱塩基性にするためでもあります。酸性条件下ではDNAは有機層に行ってしまいます。弱塩基性にしてリン酸基の電離度を高めることでDNAは水層に残ります。逆に酸性フェノールでDNAを除去しRNAを水層に回収するのがAGPC法。 TE飽和でも最初はTris bufferで飽和すべきです。 Tris buff飽和ができたのち、水相をTEで置き換えます。 最初からTEだとTris濃度がうすすぎて、フェノールがTris飽和しにくくpHを8にするのに苦労します（バッファー交換の回数が増える）。 Molecular Cloningで1 M, 0.5 Mと濃いTrisでやっているのもpHを早く8にするためです。一回目の平衡化をバッファーでない、ただの1 M トリス溶液（pH が高い）でやる変法もあります。 自作するときは、Molecular Cloningがそうだったと思いますが、最終的に0.1 M Tris (pH 8)が水層になるようにして完成ですが、市販品だとTEに置き換えているのが多いみたいですね。あんまり意味ないと思いますけど。 なお、フェノールを含水させて液化すると体積が倍近くなります。そのフェノールの体積に対して同体積のバッファーで処理しますから、それだけの体積になることを頭に置いておくように。 例えば500 mLビンに入ったフェノール（常温固体）に加水して液化しようとしたら、そのビンではあふれてしまいます。入れられるだけの少量の水を加えたらあとは50-60℃の温浴で液化し、大きなビンに移してから平衡化の作業をしなければなりません。あるいは温浴だけで融かして必要分だけ分けてから平衡化するとか。

(無題) 削除/引用 No.7618-8 - 2019/01/29 (火) 13:11:55 - レベル２９のライチュウ 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd edition)」では0.5Mと0.1Mトリス(Tris-HCl)を使え平衡化しました。 PCI溶液で、このトリスで平衡化したものとか、TEバッファーで飽和したフェノール、二つ中のいちを使いますか?なお、フェノールの平衡化はフェノールと容積が同じトリスを使いますが、飽和する方法も似通ってますか?

(無題) 削除/引用 No.7618-7 - 2019/01/29 (火) 13:07:43 - AP >平衡化は中途半端？な濃度でも使います。 この意味がわからない。平衡化したならその時点で平衡している。中途半端というのはありえない。中間段階の平衡化状態が、最終的に目指している濃度やpHに達していないということだろうか。それなら中間段階の「中途半端」な状態も、それぞれの時点で飽和しているわけだが。

(無題) 削除/引用 No.7618-6 - 2019/01/29 (火) 12:59:38 - AP >[Re:5] mozさんは書きました : > 「見かけ上、溶媒と溶質の出入りがなくなる状態ですから、一種の飽和と言えます。」 > ＞違いますよ。平衡化です。 もし、岩波の理化学辞典があったら「飽和」の定義を見てほしい。

(無題) 削除/引用 No.7618-5 - 2019/01/29 (火) 12:50:17 - moz 「見かけ上、溶媒と溶質の出入りがなくなる状態ですから、一種の飽和と言えます。」 ＞違いますよ。平衡化です。

(無題) 削除/引用 No.7618-4 - 2019/01/29 (火) 12:42:49 - AP Equilibrated/Saturated phenolだけでは意味をなさなくて、何に、何で平衡化/飽和したのかか大事ですね。 water (Tiris buffer)- Equilibrated/Saturated phenolとか言うもんでしょう。 両者は結局、同じことを指しています。 フェノールは常温個体で、水を吸収することで液化します。 一方、水は水でフェノールをある程度、吸収します。 ある温度条件で、フェノールがそれ以上水を吸収しなくなったとき、水飽和フェノールです。この状態は、結局、水に対するフェノールの出入り、フェノールに対する水の出入りが平衡化した状態です。 バッファーの場合は、水だけでなく溶媒の出入りも、既定のバッファー条件に平衡化する必要があります。これにしたって、見かけ上、溶媒と溶質の出入りがなくなる状態ですから、一種の飽和と言えます。

(無題) 削除/引用 No.7618-3 - 2019/01/29 (火) 12:29:09 - moz PCIの場合、「水(TE)で飽和させたフェノール」は使いますけど、「Trisで飽和させたフェノール」は使いません。 「Trisで中和させた（pH8に平衡化）させたフェノール」は使います。

(無題) 削除/引用 No.7618-2 - 2019/01/29 (火) 12:25:12 - moz 字面の通り違います。 飽和はMax、平衡化は中途半端？な濃度でも使います。

飽和フェノールの意味って 削除/引用 No.7618-1 - 2019/01/29 (火) 11:07:29 - レベル２９のライチュウ おはようございます。 PCI溶液の作り方を調べていますが、なんか混乱していることがあります。 Equilibrated phenolとSaturated phenolは同じ意味ですか?作るとき水やトリスで作るけど。

全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---