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gRNAデザイン用のツールは何を使っていますか？ トピック削除
No.7615-TOPIC - 2019/01/28 (月) 10:44:06 - gRNA
いつも勉強させてもらっています。

この度、CRISPR-Cas9を利用してある遺伝子の3’にタグを挿入しようとしています。
そのため独自にgRNAをデザインする必要性にかられています。

私はこれまでCHOPCHOPを使ってgRNAをデザインし、多くのノックアウト体を取ってきましたが、今ではシグマやら多くの企業が有用なgRNA配列を公開しているので、わざわざ独自でいくつか候補をデザインして、その中で比較する、ということも昨今はなくなってきました。それはそれで大変ありがたいことです。

今回、ノックアウトではなく、タグの挿入となりますと従来の独自のデザインでgRNAを作る必要があります。従来同様CHOPCHOPを使ってgRNAをデザインしてみましたが、どれもゲノムの二本鎖切断（DSB）能が悪く、いいgRNAではありませんでした。

そこで、今もっともよく使われてるgRNAのデザインソフトはなんだろうかと思い、トピックを立てさせてもらいました。このランキングというのは特異性（オフターゲット効果のなさ）のみで規定されているのか、はたまたgRNAの標的ゲノム領域へのアクセスビリティをも評価されているのか（それはないですよね...）、わかっていませんので、もし効率的なDSB能を持つgRNAをデザインするサイトがあればご教授いただきたいです。

どうか、宜しくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.7615-3 - 2019/01/30 (水) 05:23:56 - Karas
いまやgRNAデザインソフトだけで50を超え、デザインソフト比較の論文までもが出ています（Benchmarking CRISPR on-target sgRNA design, Yan et al., Brief Bioinform, 15 Feb 2017）。とはいうもののknock-in率はindel率と正比例するという感覚に反し、あまりindel率ほどは正確に予想してくれないという印象を持っています。

またノックアウトと違いノックインでは狙った箇所近くに必ずしも良いNGGが無い事も多く、SaCas9やSpCas9-NGといった他の種類を試す必要に迫られることもありました。

以上から私は2種類のソフト（Fang Zhang labのCRISPR DesignとGeorge Church labのsgRNA Scorer 2.0）を両方使って、両方で良いスコアが出たものと片方だけで非常に良いスコアが出たものを培養細胞で試し、その上で動物に使用しています。

これまで使ったことがあるものは以下のソフトです。

CRISPR Design (Total score%=On score minus Off score; Off target number; off target sites)
A tool that identifies putative CRISPR/Cas9 sites for S. pyogenes Cas9 in mouse/rat/human genomes. We can download output gRNA sequences as a genbank format.

sgRNA Scorer 2.0 (On score; Off target number; off target sites)
A tool that identifies putative CRISPR/Cas9 sites for either S. pyogenes Cas9 or S. thermophilus Cas9 in mouse/rat/human/macaque genomes

DESKGEN (On score; Off score; GC contents)
A tool that identifies putative CRISPR/Cas9 sites for S. pyogenes Cas9 in mouse/rat/human genomes considering GC%, homo polymer, UUU, transcript variations.

Benchling (On score; Off score)
A tool that identifies putative CRISPR/Cas9 sites for some Cas9 variants in mouse/rat/human/macaque genomes.

(無題) 削除/引用
No.7615-2 - 2019/01/28 (月) 11:25:36 - AA
CHOPCHOPは比較的良好な結果を出しやすいサイトだとは思いますが
やはりいくつかのアルゴリズムで共通して選ばれるようなものを試されるといいと思います。
個人的にはCRISPORというサイトが複数のアルゴリズムで同時に比較できるのでおすすめです。

下記はZhang labのHPで紹介されているgRNA design toolです。
ttps://zlab.bio/guide-design-resources

gRNAデザイン用のツールは何を使っていますか？ 削除/引用
No.7615-1 - 2019/01/28 (月) 10:44:06 - gRNA
いつも勉強させてもらっています。

この度、CRISPR-Cas9を利用してある遺伝子の3’にタグを挿入しようとしています。
そのため独自にgRNAをデザインする必要性にかられています。

私はこれまでCHOPCHOPを使ってgRNAをデザインし、多くのノックアウト体を取ってきましたが、今ではシグマやら多くの企業が有用なgRNA配列を公開しているので、わざわざ独自でいくつか候補をデザインして、その中で比較する、ということも昨今はなくなってきました。それはそれで大変ありがたいことです。

今回、ノックアウトではなく、タグの挿入となりますと従来の独自のデザインでgRNAを作る必要があります。従来同様CHOPCHOPを使ってgRNAをデザインしてみましたが、どれもゲノムの二本鎖切断（DSB）能が悪く、いいgRNAではありませんでした。

そこで、今もっともよく使われてるgRNAのデザインソフトはなんだろうかと思い、トピックを立てさせてもらいました。このランキングというのは特異性（オフターゲット効果のなさ）のみで規定されているのか、はたまたgRNAの標的ゲノム領域へのアクセスビリティをも評価されているのか（それはないですよね...）、わかっていませんので、もし効率的なDSB能を持つgRNAをデザインするサイトがあればご教授いただきたいです。

どうか、宜しくお願い致します。
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