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(無題) 削除/引用 No.7604-18 - 2019/01/25 (金) 20:43:42 - AP >つまり、溶出時に塩を加えるだけで、加熱により再アニールしない場合には、 再結合したDNAは完全に綺麗に結合しているわけではなく、 不正な塩基対合も含んでいる可能性が高いということですよね？？ 実際分子の世界でどういうことが起こっているのかちゃんと調べた報告はないのでわかりませんが、 バインディングした状態では部分変性で一部対合がのこっていて、それを低塩濃度で溶出するとトドメを刺してしまう。塩溶液で溶出すれば部分解離がもとに戻ってもとの二本鎖ででてくるとか。 あるいはシリカ界面で起こる化学反応は溶媒中とはパラダイムが違って完全に解離した二本鎖も、ほぼ完全に戻るとか、 >それなら、グアニジンによる精製時に溶液を冷やしながら行えば良いのでしょうか・・・？ グアニジンが低温で析出しやすいので、それも限度があるんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.7604-17 - 2019/01/25 (金) 14:08:48 - tetuo 塩を入れると回収率は下がると思っていたのですが 実際試してみると50 mM NaClくらいだとほとんど誤差程度にしか変わりません 100 mMを超えると結構減ってきますが・・・。 ところで、 > 加熱するってのは分子内水素結合のような不正な塩基対合を解除するためです。現に、一本鎖に変性してしまったということは、すでに水素結合が切れた状態でそれが維持されているということでしょう。 つまり、溶出時に塩を加えるだけで、加熱により再アニールしない場合には、 再結合したDNAは完全に綺麗に結合しているわけではなく、 不正な塩基対合も含んでいる可能性が高いということですよね？？ それなら、グアニジンによる精製時に溶液を冷やしながら行えば良いのでしょうか・・・？

(無題) 削除/引用 No.7604-16 - 2019/01/25 (金) 12:57:25 - AP >初段のカオトロピック塩によるシリカ吸着の段階で >短い一本鎖になっているのであれば、 >シリカに吸着せずに精製で除去されてしまうのではないでしょうか？ これもQiagenのFAQに「一本鎖の収率は二本鎖の半分程度」ということが書いてあります。一本鎖でもゼロってことないわけです。 >また、再加熱せずとも >溶出液にNaClを加えるだけで >一本鎖が元の二本鎖に戻るのはなぜなのでしょうか？ 加熱するってのは分子内水素結合のような不正な塩基対合を解除するためです。現に、一本鎖に変性してしまったということは、すでに水素結合が切れた状態でそれが維持されているということでしょう。 溶出液に塩を加えるというのは溶出効率を落とす可能性もあると思うんですが。核酸はシリカとカチオンの塩橋で結合していて、それを溶出するには洗浄で塩濃度を下げていき、塩濃度ゼロで溶出するものと理解していますので。

(無題) 削除/引用 No.7604-15 - 2019/01/24 (木) 23:06:05 - tetuo ありがとうございます。 これって訳すと 初段のカオトロピック塩によるシリカ吸着の段階で DNAは変性することがある。 もしその場合には 精製後に95℃で加熱して再アニールするか 溶出液にNaClを含んだものを用いれば良い。 ということですよね。 実際、溶出液に100 mM NaClを入れたところ、 電気泳動上で変性によるバンドが消失することが確認できました。 そのため、溶出液の塩濃度が薄すぎるために DNAが変性しているのではないかとも考えていました。 疑問としては、 つまり、 初段のカオトロピック塩によるシリカ吸着の段階で DNAは変性したとしても、溶出液にNaClを入れれば、 溶出時にまた再アニールするということですよね？ しかし、 初段のカオトロピック塩によるシリカ吸着の段階で 短い一本鎖になっているのであれば、 シリカに吸着せずに精製で除去されてしまうのではないでしょうか？ そうすると溶出時にアニールしようとしても いなくなっているので元に戻らないのでないでしょうか？ また、再加熱せずとも 溶出液にNaClを加えるだけで 一本鎖が元の二本鎖に戻るのはなぜなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7604-14 - 2019/01/24 (木) 21:37:25 - AP キアゲンで添付の標準ハンドブック（マニュアル）のトラブルシュートの最後の方にさりげなく書いてあります。 たしかBulluteinのようなもので写真付きで報告されていた気もするんですが、 今見つかるのは https://www.qiagen.com/jp/resources/faq?id=e30d9afb-1b46-45d3-b096-dd11eadb01c5&lang=en

(無題) 削除/引用 No.7604-13 - 2019/01/24 (木) 19:53:57 - tetuo APさん ご回答ありがとうございます。 ここに、realtime PCRはありません。 やはり装置の購入が必要なのですね。 > そういえば、キアゲンのフラグメント精製系も グアニジウムを使ってんだけど、 > 短フラグメントを精製すると、しばしば一本鎖に解離するトラブルがあることがマニュアルにも書いてある。 今、正にこれを問題としていました。 キアゲンの精製キットもいくつか手元にあるのですが マニュアルのどこにDNAが変性することに関して記載がありますか？

(無題) 削除/引用 No.7604-12 - 2019/01/24 (木) 17:26:27 - AP そういえば、キアゲンのフラグメント精製系も グアニジウムを使ってんだけど、 短フラグメントを精製すると、しばしば一本鎖に解離するトラブルがあることがマニュアルにも書いてある。

(無題) 削除/引用 No.7604-11 - 2019/01/24 (木) 16:53:39 - AP 古くはOD260を測定しました。 一本鎖になると吸光度が上がります。 Tmはすべての分子が二本鎖である温度のときの吸光度と、すべての分子が一本鎖になったときの吸光度の、中間点を与える温度、すなわち、1/2の分子が一本鎖に解離する温度です。 最近じゃ、どこでもrealtime PCR装置持ってるでしょう。 その基本機能として融解曲線 melting curveを求める機能がついてますね。 一本鎖になるとインターカレータが外れて蛍光が減弱することを利用しています。

(無題) 削除/引用 No.7604-10 - 2019/01/24 (木) 16:24:29 - 格さん "DNA Tm 測定"でググってみたらいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7604-9 - 2019/01/24 (木) 16:21:08 - tetuo 論文ありがとうございます。 非常に参考になりました。 ちなみにTm値を実測するのってどうやれば良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7604-8 - 2019/01/24 (木) 15:22:10 - AP https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0006291X68905822 あー、確かにグアニジンより尿素のほうがTmを下げる効果は高いようだ。 グアニジンは高濃度ではカオトロピック剤として作用しTmを下げる（尿素ほどではないけれど）けれど、低濃度では（おそらく塩濃度を上げるために）二重鎖を安定化させる作用があるらしい。 イオン化する塩か、尿素のようにイオン化しないか、はたしかに１つのパラメータだけれど、常温で二重鎖を解離しないことも、カオトロピック剤として通常のバッファー中より低い温度で乖離させることも同じだ。 ゲル切り出しキットで、グアニジン中で加温してゲルを溶かし、シリカで精製するやつあるでしょう。ゲルを溶かすときの温度が50℃くらいに指定されているけれど、うっかり間違って68℃とかでやっちゃうとDNAは変性しますよ。

(無題) 削除/引用 No.7604-7 - 2019/01/24 (木) 14:46:17 - AP ちがーう。 電気泳動の系に余計なイオンを入れたらだめでしょうが。 電圧によってイオンが移動し大電流が流れて発熱するけど、核酸の移動は妨げられる。

(無題) 削除/引用 No.7604-6 - 2019/01/24 (木) 14:22:23 - tetuo ご回答ありがとうございます。 > じゃあ、変性ゲルで尿素の代わりにグアニジンも使えるんじゃないかというとそうはいかない。グアニジンは塩であり、溶かすとイオン化してしまうから。 この部分に関してなのですが、 NaClなどのイオンを溶液中に入れるとTm値が上がることが知られていますが、 グアニジンは塩であり、カオトロピック塩によるTmを下げる効果と 塩によるTmを上げる効果が相殺されてしまい、 変性剤としては機能しにくい、という意味でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7604-5 - 2019/01/24 (木) 14:04:39 - moz guanidine DNA denatureでぐぐればでてくるぞ。

(無題) 削除/引用 No.7604-4 - 2019/01/24 (木) 14:02:21 - AP ホルムアルデヒドじゃなくてホルムアミド ハイブリの溶媒にTmの調整のためにいれたりする。 もちろん水素結合を解いて二次構造を取らないようにするためにシークエンスサンプルの溶媒なんかとしても。 勘違いしないでほしいのは、ホルムアミドにしても尿素にしてもTmを下げるだけで、それだけで一本鎖に変性するわけじゃない。サンプルを事前に熱変性したり、泳動時のゲル温度を高温に保つことと組合せて水素結合による対合を阻止している。それはグアニジンも同じこと。 したがって、常温で抽出精製操作をしているようなときには、尿素にしてもグアニジンにしても（どちらも核酸抽出精製に用いられる）、二重鎖を解離しない。 じゃあ、変性ゲルで尿素の代わりにグアニジンも使えるんじゃないかというとそうはいかない。グアニジンは塩であり、溶かすとイオン化してしまうから。

(無題) 削除/引用 No.7604-3 - 2019/01/24 (木) 13:42:05 - tetuo それはそうなんですが、 https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/nucleic_acid/vol4.html このページを見ますと 尿素やホルムアルデヒドはDNAのTm値を20℃程度下げると書かれてあります グアニジン塩がどの程度下げるのか、 他のカオトロピック塩と比べてその影響は少ないか ということを知りたいのですが 文献などご存じでしたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.7604-2 - 2019/01/24 (木) 13:40:08 - おお カオトロピックイオンは水の極性を奪い疎水的な環境を作るため、たんぱく質の構造上内部にありそうな疎水的環境を構成している部分を分子表面に引き出し変性させる。 二本鎖のDNAの内部は疎水的な結合より水素結合などにより維持されてますよね。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0006291X68905822

グアニジンでDNAは変性しないか 削除/引用 No.7604-1 - 2019/01/24 (木) 13:11:55 - tetuo 変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動という手法があり、 これは尿素やホルムアミドなどの変性剤を使って DNAの2本螺旋を解いた上で電気泳動で分離するというものです。 一方で、塩酸グアニジンという物質もタンパク質を変性させるのに一般的に使われています。 ただし、この塩酸グアニジンはDNAの精製キットなどで シリカカラムにDNAを吸着させるためにも用いられており、 恐らくDNAを変性させないのではないかと思います。 塩酸グアニジンはDNAを変性させないのでしょうか？ もしそうだとして、なぜ塩酸グアニジンだけDNAを変性させないのでしょうか？

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