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(無題) 削除/引用 No.7599-9 - 2019/01/30 (水) 18:37:10 - マウス小腸 x様 ありがとうございます。大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.7599-8 - 2019/01/25 (金) 07:07:43 - x ペルオキシターゼのクエンチは、予備実験で不要と判断した時は省略。入れる場合は抗原賦活直後、メタノールを使う場合のH2O2は0.3%。TrisEDTA (pH9)で抗原賦活時は内在性ビオチンのブロックを入れ、Citrate (pH6)の場合はケースバイケース。MOMはVectorのプロトコル通りで、一次抗体濃度は可能な限り下げる、といった感じです。状況に応じて調整が入るため、定型プロトコルになるのはMOMのところだけです。

(無題) 削除/引用 No.7599-7 - 2019/01/24 (木) 19:08:55 - マウス小腸 皆様 皆様、本当にありがとうございます。 大変勉強になりました。 ペンペン様の言われるように、IgA酸性プラズマ細胞などが染色されているのかもしれません。蛍光標識がダイレクトラベルされた一抗体を使って染色するのもひとつの手段かなとも思いました。 AP様の言われるように一度、Vector laboratoriesに問い合わせてみます。 X様にご指摘された、プロトコルの件ですが、実は私も一次抗体の反応後にペルオキシダーゼをクエンチしてもいいのかと疑問に思っていました。 研究所の先輩（皮膚専門の方）から、「このプロトコルでやれば大丈夫」と、教えていただいたプロトコルなのですが、改善すべき点がありそうです。 H2O2も古いものを使っているので買った方がいいかもしれません。 ちなみにX様はどのようなプロトコルで染色されていますでしょうか。 もしよろしければご教示いただけたら幸いです。 二次抗体はM.O.Mキットに入っているものを使っています。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.7599-6 - 2019/01/24 (木) 14:15:03 - AP まあ、一応、メーカーはできると言っているのだからできることになっているんでしょう。小腸切片での使用例の写真をデモとして載せているくらいですから。 個々の問題についてはVector laboratoriesに問い合わせるのが一番いいと思う。歴史ある会社だしノウハウも蓄積しているだろう。

(無題) 削除/引用 No.7599-5 - 2019/01/24 (木) 09:52:44 - ぺんぺん ぺんぺんです。 トピ主さんは、 ”はじめに一次抗体無しで二次抗体のみの非特異的な染色が出るかどうか検討しました。” というように、はじめに一次抗体はなしで、とのことですので、二次抗体のバックやその人食い性を疑われたのだと思います。なので、私は”それは非特異的ではなくて、特異的なものではないでしょうか？”とコメントした次第です。 ぺんぺんからは以上です。

(無題) 削除/引用 No.7599-4 - 2019/01/24 (木) 05:32:38 - おお >[Re:2] ぺんぺんさんは書きました : > ＞この非特異的な染色をできるだけなくしたいです。 > > これは非特異的な染色というわけではないと思います。 質問の内容は一次抗体特異的と言う意味じゃないかな・

(無題) 削除/引用 No.7599-3 - 2019/01/24 (木) 05:23:52 - X M.O.Mキットの原理は、キットに含まれる抗マウスIgG二次抗体と同じ抗体を、ビオチン化されていない状態でブロッキング試薬に入れる事により、二次抗体が結合し得る抗原（内在性IgG）をあらかじめマスクするものと理解しています。原理通りに機能すれば、二次抗体が結合しうる内在性抗原（形質細胞含め）はブロックされるはずですが、個人的な経験（かなり昔ですが）では、それほど綺麗に行かない場合も多く、一次抗体を他の動物種に変えて対応した事もあります。ただ、粘膜固有層が特異的に染色された経験はなく（どちらかというと腸上皮の方が問題になったように記憶してます）、トピ主さんのサンプルで見られた染色パターンには、他に理由があるかもしれません。 プロトコールを見ると、内在性ビオチン活性による非特異染色の可能性が否定できないと思われ、一回、二次抗体も抜いて染色して見たほうが良いように思います。VECTASTAINだけで染色が出るようなら、内在性ビオチン活性をブロックしたほうが良いかもしれません。 M.O.Mキットの原理上、二次抗体はM.O.Mキットに入っているものを使う必要があります。VECSTATAIN Elite ABC場合、こちらにもビオチン化された二次抗体が入っていますが、こちらを使っているということはありませんよね？　あと、今回の問題には直接関係ありませんが、一次抗体の反応後にペルオキシダーゼをクエンチした事がなく、一次抗体を入れた場合にこのプロトコールで行けるのか、ちょっと心配です。

(無題) 削除/引用 No.7599-2 - 2019/01/23 (水) 13:28:03 - ぺんぺん Biotinylated anti-mouse IgG 15 min RT ↓VECSTATAIN Elite ABC Reagent 15 min RT この反応では、ラミナプロプリアやIELのB細胞も染まるでしょう。特にIgA酸性プラズマ細胞のことです。 なので、 ＞この非特異的な染色をできるだけなくしたいです。 これは非特異的な染色というわけではないと思います。

マウス小腸の染色 削除/引用 No.7599-1 - 2019/01/23 (水) 10:13:06 - マウス小腸 現在、マウス小腸のDAB染色を行っています。 目的の一次抗体がマウスIgGモノクロなので、M.O.Mキットを使用しています。 小腸の染色、またはM.O.Mキットの使用が初めてでしたので、はじめに一次抗体無しで二次抗体のみの非特異的な染色が出るかどうか検討しました。 検討したところ、小腸柔毛の内部の粘膜固有層？が染色されました。 目的の一次抗体で染色される細胞は粘膜固有層に局在する可能性もあるため、この非特異的な染色をできるだけなくしたいです。 小腸の染色に関して、なにか良い方法やコツをご教示いただければ幸いです。 また、小腸をM.O.Mキットを使って染色するときどうしても粘膜固有層が非特異的に染色されてしまうものなのでしょうか。 よろしくお願い致します。 以下、プロトコルです。（washなどは省略しています。） ↓Deparaffinization ↓10 mM Citrate buffer (pH 6.0) Autoclave: 120 °C, 15 min ↓M.O.M. Mouse Blocking Reagent 1 hr RT ↓M.O.M. Diluent 5 min RT ↓x 100 dil. 一次抗体 O/N 4 °C ↓3% H2O2/MeOH 15 min RT ↓Biotinylated anti-mouse IgG 15 min RT ↓VECSTATAIN Elite ABC Reagent 15 min RT ↓DAB reaction 3-5 min RT

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