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(無題) 削除/引用 No.7570-15 - 2019/01/26 (土) 05:22:12 - おお TOP10において、Transformantsの増殖はそんなに悪くなく、誘導で発現が見られました。GSTに対しての抗体をつかったWBではシングルバンド（ノンスペと思われるのもをのぞけば）で検出され分解産物などはあまり多くないかもしれません（ただし精製してみないと結論がだせるかどうかわかりませんけど）。量的にはかなり少ないかなと思いますがスケールをあげてカバーできるかやってみたいと思ってます。 アドバイスをくださった みなさんありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7570-14 - 2019/01/18 (金) 17:16:18 - おお 中年さん 返答していただきありがとうございました。他の方もLon＋の株で成果を上げているようですので、やってみることになりました。

(無題) 削除/引用 No.7570-13 - 2019/01/18 (金) 14:23:13 - 中年 lon-の株由来のものと比較はしていないし、そもそも丈夫なタンパク質であったのかもしれませんが（シングルドメインなので）、DH5alpha由来の組換えタンパク質も4℃に保存して1週間ほどアッセイに用いて何の問題もありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.7570-12 - 2019/01/18 (金) 08:05:16 - おお No.7570-6 - 2019/01/17 (木) 16:19:04 - みさん No.7570-7 - 2019/01/17 (木) 16:57:58 - APさん コメントを見過ごしていていまきがつきました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7570-11 - 2019/01/18 (金) 06:06:45 - おお SYBR masterさん トリプトンのラクトース混入の可能性について、なるほどとおもいました。Autoinduction　systemの解説ありがとうございました。 Top10の使用例も参考になりました。メインにはTop10をプラスミドConstructionと精製につかってますので、早速それに導入して、発現と増殖を確認したいと思います。たぶんこれでプラスミドを精製したのでBL21（DE３）で経験したより扱いやすいだろうと思えます。

(無題) 削除/引用 No.7570-10 - 2019/01/17 (木) 18:50:29 - SYBR+master 追加 グルコース添加の液倍で増えない場合、Autoinduction　systemはたぶん使えません。大腸菌が増殖に使用するのはグルコースで、誘導に使用されるのがラクトースなので。 ちなみにAutoinduction　system用の培地の簡便な作り方は、 終濃度(w/v) 0.2% ラクトース,0.05% グルコース になるように加えればOKです。Originalのstudier 2005 では、サプリメントとして色々金属など加えてますが、サプリメントは無くても発現誘導はできます。

(無題) 削除/引用 No.7570-9 - 2019/01/17 (木) 18:38:36 - SYBR master >[Re:8] おおさんは書きました : > LBでも、それにグルコース入れてもほとんど増えないんですよね、、、 同一メーカーの培地成分でも、特にトリプトン(or ペプトン）のロット差によって、leaky発現に違いがあることが経験としてあります。トリプトンはカゼイン由来ですから、たぶんラクトース混入は避けられないし、その量はばらつく、とその時は結論づけましたが、はっきりと確認はしていません。昔のBacto tripton成分表だと、たしか10%近くが炭水化物だと記憶しています。 液培で増えが悪い場合、添加するグルコース濃度を1 %(w/v)まで上げていましたが、max 1%まで上げても駄目なら、ホスト変えた方が良いと思います。 Top10は、出入りしている博士課程の留学生が、BL21に入れ損なって(意味がわからんが）、Top10で誘導掛けて、目的タンパク取ってましたよ。

(無題) 削除/引用 No.7570-8 - 2019/01/17 (木) 17:17:16 - おお ＞totoさん >LB-Auto Induction Medium LBでも、それにグルコース入れてもほとんど増えないんですよね、、、なのでAuto Induction Mediumでも増えてグルコース消費して誘導かかるようになるのがいつになるか、、、１週間たってもそのレベルに達する自身がない。 プレートやアガロースゲルを含んだ培地で培養して菌を増やせばもしかしたらいけるのかもしれませんが、、、 ＞BL21と比較すると、 ありがとうございます。BL21は使ったことがないので貴重なじょうほうでした。ｐGEXにはT7Polは必要ないので、原理的にはBL21で十分と思ってはいましたが、、、まあ手元がないのと、BL21系でほぼ同等（と勝手に思っている）でフォールディングその他でどちらかに特徴があるわけでないバクテリアをあれこれ使い分けるというのもあまりどうかなあとおもってはいましたので。 ＞中年さん ＞貰ったラボの人に方法を尋ねたらDH5alpha DH5alphaでやってたのですね。可溶性のフラクションにタンパクが出てきたというのは面白いですね。発現させるという意味では毒性があるときなどDH5alphaなどのK株はやる価値がありそうです。DH5alphaはlON　Proteaseが生きていると思いますが、発現させたタンパクの断片化は目立ちませんでしたか？ ＞APさん ＞DE3は一部のpET系ベクターなどのT7発現系につかうものなので、不必要な仕掛けです。 存じ上げてはいるのですが、、、上記に書いたような理由で今まで使い分けてはきませんでした。ただ両者ちゃんと使い分けたりしているラボでいろいろと感触があれば聞きたいので、それは新たにトピ上げようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.7570-7 - 2019/01/17 (木) 16:57:58 - AP DH5alphaはlacI+なのでIPTGを加えなくてもlacプロモータが非常にleakyです（だから青白選択もIPTGを必要としない）。 毒性の問題がないタンパク質ならいけるでしょうけど、またベクターにlacIqが乗っているとはいえ、誘導かけなくても毒性のため増えてこないようなものには逆効果でしょう。

(無題) 削除/引用 No.7570-6 - 2019/01/17 (木) 16:19:04 - み 自分はpGEXシリーズならとりあえずクローニングも蛋白発現もDH5aでやっています。 蛋白の性質や分子量によりますが発現量は非常に多いです。 限定分解が見られる場合はBL21に移行させています。 発現が芳しくなかったり不溶性の場合は低温（25-30度）でゆっくり攪拌しながらIPTG誘導しています。 pETの場合はBL21(DE3)に入れ替えてから発現チェックしています。

(無題) 削除/引用 No.7570-5 - 2019/01/17 (木) 15:55:34 - AP >液体の培地に移した途端増殖をほとんどせず、 というところからすると、発現しないという問題よりむしろ、leaky epressionで発現したものが毒性という可能性が高いですね。 ・発現を緩和するために、温度を下げて培養する（室温〜18℃） ・DE3にもpGEXにもlacIqが乗っているんですけど、ほかのlacIqの効きの良い宿主系統を使う。JM109やXL1-Blueはクローニング向きの宿主ですが、タンパク質発現にも使われます。JMではやったことあります。プロテアーゼ欠損株でなくてもいうほど分解が進んでいるようには見えなかった。 TOP10も実はlacIqだそうなので、使えるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7570-4 - 2019/01/17 (木) 15:32:14 - AP DE3は一部のpET系ベクターなどのT7発現系につかうものなので、不必要な仕掛けです。IPTGの誘導でlacプロモータからT7 RNA polを発現する仕組みで、T7 polがベクターに乗せた遺伝子を発現するってやつですね。DE3あっても動くかも知らんけど、余計なものがあると何が起こるかわからない。単純にはDE3上のT7の発現がとベクターに乗せた遺伝子の発現に干渉するかもしれない。 ただのBL21のほうがいいんじゃない？

(無題) 削除/引用 No.7570-3 - 2019/01/17 (木) 13:45:57 - 中年 他所から貰った発現コンストラクトをBL21で発現しようとしてほとんど不溶性になったことがありました。貰ったラボの人に方法を尋ねたらDH5alphaを使ってるとのことだったのですが、そんなことで変わるものかなと思いつつやってみたら、発現量は半分程度ながら大半が可溶性に来た経験があります。増殖が遅いのが良かったのかななどとそのときは思いましたが、本当のところは不明。

(無題) 削除/引用 No.7570-2 - 2019/01/17 (木) 13:11:17 - toto 以前は教科書通りにタンパク発現はBL21(DE3)やtagaraのタンパク発現用の菌体でやってましたが、あまりいいこともなかったので、今ではほとんどクローニングして取れたクローンをplateからそのままLB-Auto Induction Mediumに入れてタンパク発現してます。IPTGを加えるタイミングに悩む必要も無いので楽ですし、高い再現性が得られます。クローニング用菌体では多少はleakyで、4度で保存したplateの状態でも1ヶ月くらいすると、コロニーにものが発現が認められます。 収量はものによって全く違いますが、BL21と比較すると、多めに取れてる印象があります。分解されたという経験は、良く取れてるものについては特にありません。 クローニングに用いた菌体を直接使って取れないときは、BL21等でtranformしてやりなおしたことも何度かありますが、よかったことはほぼないです。その場合は配列を変えて作り替えるようにしてます。

K-12 strainで発現 削除/引用 No.7570-1 - 2019/01/17 (木) 12:20:53 - おお いまBL21[DE３]で蛋白発現を試みてます。ベクターはpGEXシリーズでTac promoterとLacIqがはいってます。 BL21[DE3]ではTransformationしてプレート上ではコロニーができるものの、液体の培地に移した途端増殖をほとんどせず、その状況でIPTGを加えとにかく発現されているか確認しようとしてますが、抗体をつかってもSpecificなバンドが確認されません。同時に行った違う蛋白では発現が認められていますので、実験系に間違えがあったとは考えていません。 で手短に考えているのは、このプラスミドはクローニング用のK-12 株で作り、十分なプラスミドがLarge prepでえられています（確かTop10を使ってた）。B21ほど増殖抑制がかかっていないと考えられます。ならばプラスミド精製で使った株をつかって蛋白を発現、精製できないかと思っています。蛋白発現用ではないのでLonプロテアーゼなど欠失してないと思いますが、このような系（他のクローニング用K-12 株もふくめ）で蛋白発現をしたことがあれば話を伺いたいとおもいます。蛋白の収量、分解物・全長の量比などどのような印象をお餅ですか？

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