BioTechnicalフォーラム [ライゲーション効率の分子のモル比の関係について]

ライゲーション効率の分子のモル比の関係について

No.7562-TOPIC - 2019/01/13 (日) 21:04:07 - とび

2種類のリニアなDNA、AとBがあり、
それぞれ相補的な非回文配列の粘着末端をもつとします。

AとBの分子量比は1:3程度です。

これらをライゲーションして
ひとつに繋げたいとします。
このとき、Aがいくら余ってもよいが、
Bはひとつ残らずなくなるまで反応させたいとします。

それなら、
Bに対して、過剰量なモル数のAを入れれば良いと思います。
例えば、Bの100倍や1000倍量のモル数のAを入れれば
全てのBは反応してなくなると思います。

これをメーカーに問い合わせたのですが、
ライゲーションにおいては、分子量の比の逆数をモル比として用いた方が良い
とご回答いただきました。

つまり、いま分子量比が1:3なので、
モル比は3:1で混合した時にライゲーション効率が良くなるそうです。
ただし、配列などによっても変わるので
10:1～3:1くらいで条件を振って、最適化を行った方が良い、とご回答いただきました。

AをBの100や1000倍量入れた場合には、
よけいにライゲーション効率が落ちるとご回答いただきました。

理由も尋ねたのですが、
ライゲーションはリガーゼがDNAの末端でアデニル化というものを起こすことで
生じるものであり、リガーゼはAだけでなくBにも付いている必要があり、
Aを過剰に入れた場合には、B側にリガーゼがつきにくくなるので
ライゲーション効率が落ちる、といった説明を受けました。

この情報は本当に正しいでしょうか？

リガーゼは溶液中で漂っているのではなく
常にDNAに結合しており、末端を探すような形で
レールを走るように動き回っているのでしょうか？
あるいは一度末端にたどり着くとそこから動かなくなるのでしょうか？

もしそうだとしてもAとBの総モル数がもつ末端数よりも
過剰なリガーゼを溶液中に入れておけば
ライゲーション効率は落ちないのではないでしょうか？

この辺り、お教え願えますでしょうか？
　

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(無題)

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No.7562-3 - 2019/01/14 (月) 23:56:59 - おお

よく分からないのですが、質問の対象はベクターとインサートで環状のDNAをつくるということでしょうか？その場合Ligationの効率というのは、実際はTransformationの活性がOutputになっているので、フィルターを解していることになります。いくらLigationがしっかりしていても３つ以上の分子の直さ、環状のLigation　Productもできるので

そうでなくて、AとBをつないで直鎖のDNAを得ようとしているなら。

＞Bの100倍や1000倍量のモル数のAを入れれば
＞全てのBは反応してなくなると思います。

一見正しいように見えますが、全体のLigation効率が５０％ならBも５０％の分子しかLigationされてないのではないでしょうか？

＞Aを過剰に入れた場合には、B側にリガーゼがつきにくくなるので
それはDNA量にたいするLigaseの量で解決するのではないでしょうか？

(無題)

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No.7562-2 - 2019/01/14 (月) 18:12:22 - いけ

Aがベクターで、Bがlibrary作成したいinsertという状況でしょうか。

wikipediaによれば
反応機構：DNAの3'末端（アクセプター）と、DNAの5'末端（ドナー）との間にリン酸ジエステル結合をつくる。よく知られている真核生物やファージの酵素では反応にATPを必要とし、以下のように進行する[1]。
1. ATPが酵素の活性中心のリジン残基に結合してAMPとなり、ピロリン酸が放出される。
2. AMPがDNA5'末端のリン酸基に転移され、ピロリン酸結合を生じる。
3. 5'末端のリン酸基と3'末端の水酸基との間にリン酸ジエステル結合を生じ、AMPが放出される。
とのことですので、1つのリン酸ジエステル結合を形成するのに必要なリガーゼは1分子です。ライゲーションは2本鎖のうち1本がリン酸ジエステル結合を生じていればよく、対側に残存するニックは大腸菌の細胞内で修復されます。

＞この情報は本当に正しいでしょうか？

反応機構については誤っていると考えますが、実際の実験として「10:1～3:1くらいで条件を振って、最適化を行った方が良い」という点は正しいです。一般的に「vector:insert = 1:3(分子数比)」と言われていますが、長いinsertを挿入する場合はinsertの分子量を多くする方が効率がよいという経験があります。

また、一般的な反応条件では、生じるコロニー数は使用したinsertの分子数に概ね比例する様です。
http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/6022_j.pdf　3ページ目の表を参照

反応系の体積、リガーゼやベクターの量は普段の実験と同様にし、libraryの多様性とcompetent cellの効率を考えて、必要な本数に分けて反応を行うのではいかがでしょうか。

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No.7562-1 - 2019/01/13 (日) 21:04:07 - とび

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