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(無題) 削除/引用 No.756-11 - 2012/07/19 (木) 20:34:41 - master >[Re:7] みさんは書きました : > 通常のプロトコールは粉末を1mM HCl中で30min膨潤じゃなかったっけ？ > あとNaHCo3のｐＨは8.3だったっけ？に合わせていますか？ 他の企業の製品は分かりませんが、自分が使用しているCNBr-activated Sepharose 4Bは15min,1mM HClで洗浄しろと書いてあります。 またNaHCo3は緩衝液として使うならば、調整しなくても大体pH8 くらいだから気にしなくていい、と先生に言われました。

(無題) 削除/引用 No.756-10 - 2012/07/19 (木) 20:23:55 - master >[Re:9] Homers2000さん >[Re:8] Brさん >[Re:6] qqさん 使用しているCNBr adtivated sepharoseは割と古いものなので確かに効率が落ちているあもしれません。 先生は「5~10mg/ml よりもっと結合はするはず、ただ固定化した後それを使って実験する時にそのぐらいの比率で結合させると使いやすい、ということじゃないか」と言われました。 なので古くなって少し結合効率が落ちてもまだまだ結合する力はある、と思って半分ほどしか結合しない事に疑問を持っていました。

(無題) 削除/引用 No.756-9 - 2012/07/18 (水) 10:23:52 - Homers2000 分子量の大きいタンパクなどは立体障害などで推定値より 結合量が少なくなることもあると思います。 また、一度開封したCNBr sepharoseは、4°Cで保存されている かと思いますが、再度ふたを開けて使用する際に、室温に戻さないで 直ぐに開けることにより、空気中の湿気を吸ってしまい がくんと結合量が減ってしまった経験があります。

(無題) 削除/引用 No.756-8 - 2012/07/16 (月) 16:45:46 - Br 20mgのゲル粉末を使ってるのが失敗の原因でしょう。少なすぎます。確かに、10mg/ml結合できるなら1mgタンパクに対しては20mgということになりますが、HCl膨潤、洗浄しているうちに壁に結合するビーズが出てくるので、必ずロスが出ます。また、その結合容量は大まかな目安で、ものによって異なります。目的にもよりますが、立体障害のことを考えて、あまりゲル中の結合リガンドの量は多くしない場合が多いと思います。 なお、重そうのpHを8.3にあわせる必要はありません。pHが8.3である必要は無いですし。

(無題) 削除/引用 No.756-7 - 2012/07/16 (月) 13:21:35 - み >[Re:5] masterさんは書きました : > > 私の行っている方法では、まずCNBr-activated-sephを必要量は測り取り1mM HClに懸濁し、これをカラムに入れてさらに1mM HClを加えて15分間洗浄します。 通常のプロトコールは粉末を1mM HCl中で30min膨潤じゃなかったっけ？ あとNaHCo3のｐＨは8.3だったっけ？に合わせていますか？

(無題) 削除/引用 No.756-6 - 2012/07/16 (月) 08:32:46 - qq ＞リガンドはこの溶液（に含まれているCNBr-seph に）5-10mg/mlまで結合するとありました。 このリガンドは、おそらく低分子リガンドのことではないでしょうか。 タンパク質のような巨大分子リガンドの結合容量は、かなり小さくなります。 固定化のSDS-PAGEでの評価の件は了解しました。結構だと思います。 ＞その結果、溶液の半分程度しかタンパク質が結合していなかったので、なぜなのかと思いました。 固定化の程度はそのようなものだということではないでしょうか。 まあ、結合容量はメーカーの売り言葉ですから、嘘ではないが誠実な表現であるとは限りません。 いつものことですが、メーカーに直接聞くのが一番です。

(無題) 削除/引用 No.756-5 - 2012/07/16 (月) 06:30:45 - master >[Re:3] qqさんは書きました : > NHS-活性化ゲルの時の感覚的な結合量は、1-10mgタンパク質/mlゲル程度かな、と思うのですが、20mgのCNBr-sephは、どの程度のゲル体積になるのですかね。 CNBr-seph 1g をbuffer 5mlに懸濁しろとプロトコルにはあり、リガンドはこの溶液（に含まれているCNBr-seph に）5-10mg/mlまで結合するとありました。その事から、1mgのタンパク質では100ul,100ulに懸濁しているCNBr-seph は20mgと考えてこの量を使用しました。 私の行っている方法では、まずCNBr-activated-sephを必要量は測り取り1mM HClに懸濁し、これをカラムに入れてさらに1mM HClを加えて15分間洗浄します。10倍量のcoupling buffer を流して1mM HClを除いた後、タンパク質溶液にゲルを加えてo/nで混合します。 > 半分以下の結合の根拠は何なのでしょう？ 結合前の溶液と結合後の溶液を、Bio-radのタンパク定量による定量と、泳動によるCBB染色で確かめています。その結果、溶液の半分程度しかタンパク質が結合していなかったので、なぜなのかと思いました。 タンパク溶液は薄い溶液(0.4mg/ml)と濃縮した溶液(4mg/ml)を用いてそれぞれ行いましたが効率が大きく上がることはありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.756-4 - 2012/07/14 (土) 21:58:19 - 参考 参考になるサイトです。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=748

(無題) 削除/引用 No.756-3 - 2012/07/14 (土) 21:22:18 - qq ＞どうも効率が悪く、半分以下のタンパク質しか結合してくれません。 効率の話をしている割に、タンパクとゲルの重量や体積が提示されていませんね。 半分以下の結合の根拠は何なのでしょう？ もっと、結合するはずと考える根拠は何故なのですか？ NHS-活性化ゲルの時の感覚的な結合量は、1-10mgタンパク質/mlゲル程度かな、と思うのですが、20mgのCNBr-sephは、どの程度のゲル体積になるのですかね。

CNBr adtivated sepharose のリガンド結合について 削除/引用 No.756-1 - 2012/07/14 (土) 18:53:24 - master Hisタグをつけたタンパク質をNiカラムで精製してきた後、タンパク質をCNBr activated sepharose に結合させようとしているのですが、どうも効率が悪く、半分以下のタンパク質しか結合してくれません。 何が悪いのでしょうか？ 手順としては 目的タンパク質をNiカラムで精製 ↓ 限外濾過で{0.1M NaHCO3, 0.5M NaCl}に溶液を置換、及び濃縮 ↓ (0.1M HClでCNBr activated sepharose を洗浄) ↓ タンパク溶液をCNBr activated sepharose と混合 (protein 1mg/CNBr-seph 20mgの比で) ↓o/n 遠心機にかけてタンパク溶液を除去し、0.1MTris-HCl,0.5M NaClの溶液を加える ↓o/n そのまま次の実験に使用 で行っています。

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