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(無題) 削除/引用 No.7552-6 - 2019/01/12 (土) 21:57:54 - 名もなき学部生 配列等の関係で、バックグラウンドにおかしなシグナルが出ることはそこそこの頻度であると思います。 精製以降の問題ではなく、反応時の問題なのではないでしょうか？ 使用するプライマーを変更して、その箇所を逆向きに読むことをオススメします。 最後に用語の問題ですが、シークエンス反応はPCRとは言わないので、お気を付けください。

(無題) 削除/引用 No.7552-5 - 2019/01/11 (金) 13:18:17 - 中年 エタノール沈殿では完全には除けません。反応効率が悪いとdye terminatorの残量が多くなるので、その分シグナルが強くなりますので、先輩との違いはそこだと思います。 LPAなどのキャリアを使って室温でエタノール沈殿をすると、dye terminatorの持ち込みは少なくなります。

回答ありがとうございます 削除/引用 No.7552-4 - 2019/01/11 (金) 11:45:03 - 学生X 回答ありがとうございます 上清の除去に関しては水滴が完全になくなるまで行っているので、 これ以上は除去しきれない程度にはやっています。 70%エタノールのwashをもう一度は次に試してみます！

wash 削除/引用 No.7552-3 - 2019/01/11 (金) 09:11:36 - あかね ポイントはエタ沈のwashの際に、上清を丁寧に除去することです。

(無題) 削除/引用 No.7552-2 - 2019/01/11 (金) 02:30:19 - おお 70%エタノールのWashをもう一度繰り返せば改善するんじゃないかな

エタノール沈殿　dNTPの共沈について 削除/引用 No.7552-1 - 2019/01/10 (木) 21:22:53 - 学生X 卒論研究のためにシークエンスを行っている大学生です。 シークエンスのためにPCR後、エタノール沈殿をしてから解析をしています。 自分がシークエンスを行うと、読み始めから70bpくらいのところに大きなシグナルが出てしまいます。(その他の場所は正常) これはBig dye terminatorの蛍光色素が除去されなかったためであるとわかりました。 精製キットを買えば解決するとは思うのですが、私個人のために購入していただくわけにもいかない状態です。 また、今まで先輩たちは変なシグナルが出たことは無かったのに自分だけ出現します。 このような状況を経験された方で解決された方、その時の解決策を教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。 参考までに行っているエタノール沈殿の手順を書きます PCR産物10μLを100%エタノール60μL、DW10μL、EDTA2Na 0.5M　1.25μLとともに1.5mLチューブに　転倒混和して15分間静置 4℃　13000rpm　20分遠心　上清を除去 70%エタノール　60μLを加えタッピング 4℃　13000rpm　10分遠心　上清を除去 ヒートブロックで55℃　エタノールをとばす Hidi 20μLを加え、ヒートブロックで95℃2分 4℃で2分クールダウン　解析

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