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cloningできたもようです!! 削除/引用 No.755-38 - 2012/07/25 (水) 14:24:24 - 教えてください。 wwnさん コメントありがとうございます。 実はwwnさんが書き込みしていただいたin-fusionで昨日から取り組んでいました。 先程電気泳動したところ、insert Aとinsert Bの融合断片が確認されました!! これを長いこと望んでいました。 あとはこれをTA vectorに組み込んで、sequencingして、それを目的のウイルスベクターに乗せ換えれば完成です。 みなさま本当にありがとうございました!! 非常に勉強になりました。重ねてお礼申し上げます。

こだわらないのなら 削除/引用 No.755-37 - 2012/07/25 (水) 13:44:13 - wwn 質問の意図とはずれますが、、、 私もどうしても正攻法、数base cutの制限酵素を用いた方法での切り貼りがうまくいかなかったことがありました。そんなとき、In-Fusionという技術を知りました。 これで行うことにより、すんなりできたことがありました。 In-Fusionを勧めるわけではないですが、ここまでうまくいかないのであれば気分一新。 原因は分からないままになるでしょうが、違う方向から攻めるのが近道かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.755-36 - 2012/07/21 (土) 12:30:45 - 教えてください。 APさんご指摘ありがとうございます。 > やっぱり、MfeIを非正規のバッファーで使っているのが気になります。さらに今回HindIIIも。どちらも低塩濃度で使用するとスター活性がでると記載されているところ、塩濃度0のバッファーを使っていますよね。一般的にいって、塩濃度をあげると切れなくなるだけですが、下げると活性が出やすくなります。 カタログのスター活性を示すことがある、というのはそれほど起こりうる確率のものなのか正直侮っていました。２つの制限酵素の至適bufferが異なる組み合わせは確かに初めての経験でした。そこで、APさんに仰っていただいた、一般論、非常に参考になりました。 sequentialに切断する問題はinsertの回収量不足なので、そこはこのトピックでいただいたアドバイスにより打開できそうです。ぜひ行ってみます。本当にありがとうございました。 > ライゲーション時のインサート：ベクターの比率は、決まったインサートをサブクローニング／リクローニングするときにはあまり重要ではありません。ライゲーション効率、たとえばあたりのコロニーが10個とれるか100個取れるかには関係しますが、取れるか取れないかに絡んでくることはないです。適当でいいと思います。 これにも目をむきました。。そうなんですね。非常に参考になりました。 また、sequentialにcutする場合は100%活性の出るbufferで行えますので、insert 0でもコロニーが出てきてしまうような未消化vectorの出現もある程度抑えられるかもしれません。 この度はありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.755-35 - 2012/07/21 (土) 12:15:38 - 教えてください。 774さん コメントありがとうございます。 > ライゲーションのモル比はどのように出してますか？ > もしODで測定してるんだったら、電気泳動のシグナルで推定した方がいいように思います。 > （既にやられてたらすみません。） ligationのモル比は、λHind3を参考に電気泳動シグナルにより大まかに算出しています。 これまでのクローニングと同様のやり方で行っています。 > 私ならモチベーションが下がってしまいそうなので、 > 制限酵素のサイトをかえてやり直すよりは、PCRを使って遺伝子をつないでからTOPOでクローニングするかなぁ。 774さん新しいご意見ありがとうございます。 PCRを使って遺伝子をつなぐというのは、deletion mutantの作製で行われるoverlap extention法（overhang法？）と言われるものでしょうか？今、紙上で考えてみると確かにこれならMfe1/Hind3 cutせず、融合遺伝子が作れそうですね。ただ、新たにprimerを設計しねばなりませんね。早速検討してみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.755-34 - 2012/07/21 (土) 10:59:31 - AP >コロニーは１：０でも10コロニーほど出てきます たぶんそれは、切れ残り（環状のまま）のプラスミドによると思います。1:0のligation反応なしでも同じじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.755-33 - 2012/07/21 (土) 10:56:38 - AP やっぱり、MfeIを非正規のバッファーで使っているのが気になります。さらに今回HindIIIも。どちらも低塩濃度で使用するとスター活性がでると記載されているところ、塩濃度0のバッファーを使っていますよね。一般的にいって、塩濃度をあげると切れなくなるだけですが、下げると活性が出やすくなります。一見、正しい長さに切れているようでも、クローニングサイトにある類似の配列でも切れていて、末端があっていないのではないでしょうか。 変なところでトラブルくらいなら、最初からEtOH沈殿でバッファー交換して二重消化したほうがよいのでは。 ライゲーション時のインサート：ベクターの比率は、決まったインサートをサブクローニング／リクローニングするときにはあまり重要ではありません。ライゲーション効率、たとえばあたりのコロニーが10個とれるか100個取れるかには関係しますが、取れるか取れないかに絡んでくることはないです。適当でいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.755-32 - 2012/07/21 (土) 10:19:54 - 774 追加というか質問になりますが、ライゲーション反応total2ulは許容されるスケールでしょうか？ これまでは水を加えてでも、10ul弱くらいのスケールでやってました。 ご存知の方がいらっしゃいましたら教えて頂けると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.755-31 - 2012/07/21 (土) 10:13:15 - 774 ライゲーションのモル比はどのように出してますか？ もしODで測定してるんだったら、電気泳動のシグナルで推定した方がいいように思います。 （既にやられてたらすみません。） 私ならモチベーションが下がってしまいそうなので、 制限酵素のサイトをかえてやり直すよりは、PCRを使って遺伝子をつないでからTOPOでクローニングするかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.755-30 - 2012/07/20 (金) 20:37:29 - 教えてください。 Harmoniaさん ご注意いただきありがとうございます。 現在、insert Aとinsert Bの融合タンパク質を作成することを目的に、それぞれのinsertをTA vectorにクローニングしました。 　ーGG-Hind3-kozak配列-gene of interest A-Mfe1-GGー（以下、insert A/Topo） 　ーGG-Mfe1-gene of interest B-Sal1-GGー（以下、insert B/Topo） 以上はsequencingにより確かめております。 そこで、「insert A/Topo」と「insert B/Topo」とをそれぞれHind3/Mfe1でdouble digestを行いました。「insert A/Topo」からはinsert Aが切り出され、「insert B/Topo」は電気泳動で見る限り、シングルバンドになりました。Hind3はTopo vectorに元々ありますので、それを利用してinsert Aを組み込み「gene A-gene B」の順で融合遺伝子を作製しています。 double digestionはグリセロール濃度、温度、時間等、気にして行っています。 その後の電気泳動後のgelからの切り出し時には、UV照射を５秒以内を意識して努めています。 QIAGENのgel extraction kitを利用してアガロースからEB bufferにて溶出を行っています。回収率は十分です。 恥ずかしながら私はポスドクで、昨年度卒業した修士の実験を引き継いでいます。 後輩が行った実験でもあり再度sequencingしたりコンストラクションをくまなくチェックを行いました。Harmoniaさんのおっしゃるようにstrategyを疑いましたが、理論的には出来ないことはないはず、と思います。非常に情けない限りです。 ここまでコンストラクションに手間取るのは初めての経験ですので、一度constructionを一から見直そうとしていますが、この考えが妥当なことなのか自分でもわかりません。それほど遺伝子の切り貼りをしてきたわけではないので、みなさまの困難に突き当たったときの第一選択をお聞かせいただければと思い、再度書き込みいたしました。 長文大変失礼しました。どうかご意見お聞かせください。

(無題) 削除/引用 No.755-28 - 2012/07/20 (金) 20:08:13 - Harmonia これだけいろいろなアドバイスが出てきて、No.755-27 に書き込みされているように、（さらっと読む限り）丁寧に実験計画されていて、なおかつゴールできないとなると、技術面のサポートではなく、クローン構築ストラテジーを疑ったほうが良いのでは？ ここの誰かが質問者さんの実験ノートを見て、アドバイスできれば、いいのでしょうが、そうも行かず。 具体的なベクター名とか、そのTAベクターに仕込んだ配列とか、ノートを見せるつもりで書いていただいたほうがいいかも。

(無題) 削除/引用 No.755-27 - 2012/07/20 (金) 19:49:39 - 教えてください。 たびたびの書き込みで大変恐縮です。 みなさまからいただいたアドバイスに従い、double digestionで充分量のinsertを確保することができました。ただ、ligationを７度行い、24クローンずつ毎回拾い上げても目的のものが取れてきませんでした。これまでの仕事では１０以上クローニングはそれほど難なく行ってきており、これほど苦労しているのは初めての経験で驚いています。 ligationの工程としては、 double digestion後に1% AGEを行い、ゲルから精製／アガロースから溶出します。（十分量回収できています。）それをligationに供しましたが目的のものが取れてきませんでした。そこで溶出サンプルにグリセロールと70% EtOHを加えてエタチンも行いましたが、それでもだめでした。 ligationはvector 0.01 pmolに対し、insert 0, 0.01, 0.05, 0.25 pmol（１：０から１：２５）の４つの比率でtotal vol 2 ulにし、そこへTakaraのligation kit ver 1.2を等量加え、16°C, 30分またはオーバーナイト行い、その後DH5αに形質転換後、Amp plateにまいています。（形質転換からplatingまではこれまでルーチンに行ってきました。） コロニーは１：０でも10コロニーほど出てきます。insertの比率を上げてもコロニーの出来具合は変わりありません。形質転換時にTakara ligation kitの�V液を添加しても変わらずでした。 ここまで駄目なのは初めての経験です。 みなさま大変恐縮ですが、ご意見お聞かせ願えませんでしょうか？ 今、新しく制限酵素サイトを変えて、再度PCRからやり直そうとしていますが、この考えというのは妥当なのでしょうか？あるいはまだ改善する余地等ありましたら、どうかご教授いただけますと幸甚です。どうか、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.755-26 - 2012/07/20 (金) 00:12:06 - 教えてください。 APさん アドバイスありがとうございます。 > 私もMfeIをBuff4ではなく、Buff 1または2で使用するという方法を提案しましたが、reliableかどうかは保証できません。 昨日、10 ugのinsertA/TopoからBuffer1を使ってMfe1/Hind3 同時cutを行いました。 その後、1% AGE後にゲルから切り出し精製すると回収量が10倍以上増加しました。 本当にありがとうございました。 実は以前、buffer2で同時cutを行っていたのですが、出てくるinsertの1% AGE後のbandの高さが、sequential digestionした時のbandの高さと微妙に違っていたので、その経験もあり、ずっとsequential digestionに拘っていました。が、昨日buffer1で同時切断すると、sequential digestionと同じ高さのbandが切り出されたので大変ホットしています。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.755-25 - 2012/07/19 (木) 23:54:05 - 教えてください。 abさん コメントありがとうございます。 abさんからのレスを受けて、精製キットで溶出前に洗浄液の確実な除去、および乾燥を念入りにした結果、回収量が大幅に増加しました。EB bufferで溶出は行いました。おおよそ10倍ほど増加しました。大変助かりました。私の知識の無さを自覚したいい機会でした。ありがとうございます。 ~さん コメントありがとうございます。 今回始めて質問させていただきました。先のトピックで便乗質問したところ改めてトピックを立てるようご指摘をいただきましたので、それに従いました。また、４点、非常に勉強になりました。20 %でもいけるとは意外です。今回、充分な量のinsertが確保できたのでligationを再度行ったのですが、明日結果が出ますが心配です。ご指摘いただいたDNAの質、に関しては思い当たらないこともありません。制限酵素処理後の切断物の精製はAGE後にUV下でcutは必須ですよね。（今回はTA vectorに入ったinsertAを、別のTA vectorに入ったinsertBに連結させることをしています。）UV下で目的の物がある場所を確認するため用のlaneと、ゲルから精製用のlaneと別々のlaneに流せばUVを全く当てず切り出すことも可能ですね。次回そうしてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.755-24 - 2012/07/19 (木) 23:44:11 - 教えてください。 THさん コメントありがとうございます。 アガロースを分解するという方法は始めて聞きました。ぜひ調べてみます。ありがとうございます。 NEさん コメントありがとうございます。 仰る通り、精製キットからの抽出過程でのロスだと思います。 昨日、２つの制限酵素を用いて同時にcutを行い、その後、キットで精製し、始めてEB bufferで溶出しました。水で溶出した時と比べて確実に回収量が増加しました。またご指摘いただいたように、もう一度水を加え、溶出するとより回収量が増加しました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.755-23 - 2012/07/19 (木) 11:52:46 - AP >2回同様の質問を繰り返すということは、前回は答えだけは分かったが、なぜその答えが得られるかが理解できていなかったということでしょうか？ そこはそれ、二者の酵素の至適buffがNaCl系だけじゃなく、KOAc系のと組合せなので、そう単純ではなかったですね。 私もMfeIをBuff4ではなく、Buff 1または2で使用するという方法を提案しましたが、reliableかどうかは保証できません。 こういう時に心配なのは「切れない」ことより（そうなったらBuff交換して切り直せばいいですから）スター活性でして、質問者さんも書いていたと思いますが、変なところで切れて、出ないはずのサイズのバンドが出たりするのですよね（もうそうなったら捨てるしかない）。他社ではスター活性が出ると警告されているバッファーでも、NEBでは警告していなかったりするので、資料上で非推奨のバッファーでも活性があるといっても注意する必要があります（しかもMfeIは同社のみであつかっているisoschizomerなので、他社の資料を参照できないし）。

前の回答が理解できていなかったのでしょうか？ 削除/引用 No.755-22 - 2012/07/19 (木) 10:22:56 - ~ >今回のMfe1とHind3のcutでも切り出しの必要はなく、酵素とbufferの補充が可能でしょうか？ 2回同様の質問を繰り返すということは、前回は答えだけは分かったが、なぜその答えが得られるかが理解できていなかったということでしょうか？ �@酵素は失活できる場合がある �Aバッファーの組成は基本的には公開されている �B塩濃度は上から入れれば上げることができる �C活性は、20%あれば結構切れる の4点を覚えましょう。 >ligationに充分なほど回収できておりません。 違うと思います。 サブクローニングであれば、1 ngなくてもライゲーションに持ち込めます。 ただ、DNA量が少ない原因は確認しましたか？ 制限酵素で切った段階で2 cutが少ないのと、制限酵素で切った後の段階では目的の長さのDNAが期待される量あるが精製後に減っているのとでは、原因が異なります。 >コロニーがでてきません。 230 ngのDNAをどう使っているかわかりませんが、それだけのDNAが取れているのであれば、問題があるのはDNA量ではないと思います。 まずは、 �@ライゲーションに持ち込むDNA(ベクターおよびインサート)には、一切のUVをあてない �Aコントロールベクターも同時にライゲーションして、コンピテントセルのタイターを調べる。 の2点を行ってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.755-21 - 2012/07/19 (木) 07:34:12 - ab 10 ug使って200 ngは明らかに少ないです。 おそらく精製の過程でロスしていると思うのですが、一つ考えられるのは、シリカビーズ系の精製キットの場合、溶出前に洗浄液が残っていると溶出の効率が下がるので、一度除いた後に再度遠心して丁寧に除いた方がよいです。溶出の際の加温も重要です。 溶出は超純水でもよいはずです。ちなみにBuffer EBはTris-HClだけで、NaClなどの塩は入っていません。なので、その後の酵素反応には影響しないことになっています。

(無題) 削除/引用 No.755-20 - 2012/07/16 (月) 09:44:42 - NE 10ugのDNAからスタートしているのであれば、2つの酵素で段階的に切断・精製した場合でも、ライゲーションに十分なDNA量が回収できると思います。 DNA精製キットも、0.5-5kbpぐらいの範囲であれば、90％程度の回収率を保証していると思います。 10ugの50%がMfeIで切断でき、90%の回収率で回収(4.5ug)。 4.5ugの50%がHindIIIで切断、90%の回収率で回収(2.0ug)。 2ugもあれば、十分量です。 仮にキットでの回収率が50%でも0.6ug回収できることになります。 今回の場合は、2つの酵素で同時に切るということよりも、DNA精製キットの手法を見直してみる、あるいは、別の精製キットに変えるという方が、最終的には大量のインサート・ベクター断片を用意できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.755-19 - 2012/07/15 (日) 11:13:55 - TH スピンカラムでのゲルからのDNA回収率が気になるなら、アガラーゼ処理でアガロースを分解してやればいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.755-18 - 2012/07/15 (日) 00:00:18 - 教えてください。 qqさん >それぞれの制限酵素で、きっちりと切れているのですか？ コメントありがとうございます。はい、vectorの方をMfe1またはHind3でそれぞれdigestしたものを電気泳動すると、シングルバンド（線状）になりますので、きちっと切断してくれているものと思います。 ただ、sequentialに切断しようとした際、２つ目の酵素で切れているかは確証は持てません。 もちろんその際にはinsertが入ったvectorからinsertAは切り出されてきますので、大丈夫だろうと考えてはいます。

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