現在、肝組織の酸化ストレスの測定のために
Cayman chemical社製のTBARS assay kitを用いて測定を行っております。
プロトコール通りやっているつもりですが、スタンダート（測定検体も含め）がほとんど発色せずにどこに手技的な間違いがあるのかわからない状態であります。実験行ったことがある方などご教示お願いいたします。
因みに下記のプロトコールで行っております。
煮沸時間を延ばすと発色しやすくなるのでしょうか？
カラー試薬の作成
(A)20mlの濃縮したTBA酢酸２VialをHPLC-grade water160mlで希釈する。
(B)20mlのTBA NaOHをHPLC-grade water180mlで希釈する。
（1060rのチオバルビツール酸（TBA）と100ml希釈TBA酢酸(A)を300ml以上のビーカーに入れる。さらに希釈TBA NAOH(B)を100ml加えTBAが完全に溶解するまで混合する。
No.10009202のMDA 250μlを750μlのDEPC水で希釈して125μM MDAストックを用意する。
8本の試験管（エッペンチューブ）にMDAストックと水を加え希釈していく。(Standardの作成)
5mlバイアル（15mlのtubeでもよい）をサンプル＋8本用意。
5mlバイアル各々にサンプルもしくはA~Hを100μlとTBA SDS溶液100μlを添加し混合する。
4mlのカラー試薬をバイアルの下側に加える。
バイアルに蓋をして垂直に保ち沸騰した水に入れ1時間沸騰させる。
1時間後すぐに氷浴に10分間入れて反応を停止させる。
4℃、1600回転/分で10分間遠心する。
室温で30分安静に保つ。
各バイアルから透明プレート（Colorimetric Assay用）の定めた位置に150μlずつ加える。
プレートを吸光度計にセットする。フィルタを540nmに設定。
測定モードを高速にする。
プロトコル測定で開始。 |
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