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(無題) 削除/引用 No.7522-9 - 2018/12/28 (金) 12:49:30 - toto 地域によりますが、今日の17時までにEurofinに発注すると明日、指定の場所（自宅などでも可）に配達してくれますよ。

(無題) 削除/引用 No.7522-8 - 2018/12/28 (金) 09:45:36 - TMR おお先生ありがとうございます。 やはりダメなご意見の方が圧倒的ですね。 ありがとうございます。年始にラッシュオーダーします。 この度はありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7522-7 - 2018/12/28 (金) 09:41:56 - おお 予想外なことが起こらない限り分泌されないでしょう。 Fc-ECDは切り刻んで何回かのステップでやっていけば制限酵素を使ってやっていけるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7522-6 - 2018/12/28 (金) 09:22:29 - TMR monさんありがとうございます。 やはり”Fc”-kozak sequence-CPD-TM-ECDは分泌されないと考えた方がいいでしょうか...。

(無題) 削除/引用 No.7522-5 - 2018/12/28 (金) 09:20:46 - mon あっ、ATGが無くなるか。。

(無題) 削除/引用 No.7522-4 - 2018/12/28 (金) 09:19:41 - mon pFUSENからFc遺伝子領域（SSなし）をXhoI(+@) で切り出せそうだから、これをin-frameで繋げる方法は無いかな。。 blunt-end ligationだと念のための配列確認が必要なので（あるいはいきなり発現実験>WBかな）、省力的か否か不明ですが。

(無題) 削除/引用 No.7522-3 - 2018/12/28 (金) 08:18:37 - TMR 独り言様、早速ありがとうございます。 やはり”Fc”-kozak sequence-CPD-TM-ECDは一型膜貫通タンパク質として産生されてしまうんですね... 私は、分泌シグナルがシグナルペプチダーゼで除去されたのち、”Fc”-kozak sequence-CPD-TM-ECDが可溶性タンパク質として小胞体／ゴルジ内腔／細胞外へと分泌されることを期待していましたが、やはりTMはTMと認識され、膜に局在してしまうのですね... やはり私のアイデアではダメっぽいですね... 他の方のご意見も参考までにお聞きしてもよろしいでしょうか？ 独り言さんありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7522-2 - 2018/12/28 (金) 08:10:19 - 独り言 Fcというものを使った事は無いですが、 一般的に膜タンパク質のN末に小胞体シグナルペプチドが存在すると、N末は細胞外に向きます。 そのため、そのタンパク質のトポロジーが逆になるので、本来の細胞外部分は糖鎖修飾されない可能性が高く、またご指摘のとおり、TMDがあれば、全く分泌されないでしょう。

Constructのご相談 削除/引用 No.7522-1 - 2018/12/28 (金) 07:49:08 - TMR 年末でプライマーオーダーが制限されている中、どうにかレビューアーのコメントに早く応えたく、プライマーを注文することなく、現時点でできることを考えています。 私は2型膜貫通タンパク質を研究しています。 N末に細胞質ドメイン（CPD）、C末に細胞外ドメイン（ECD）、その中間に膜貫通ドメイン（TM）があります。 レビュアーからは、N末にFc部位を持たせたECDのFc融合タンパク質を作るように指示がありました。 そこで本来であれば、 Fc-ECD というコンストラクトを作るべきなのですが、もちろんそれは年始にプライマーを注文して作ります。 ただ、年末にもがっつり仕事をし、いわゆるうまくいくかどうかの”感触”を知りたい衝動にかられています。 そこで今手元にあるコンストラクトである、 kozak sequence-CPD-TM-ECD in pcDNA3.1(+) 上記のいわゆる完全長の遺伝子がクローニングされたプラスミドをPme1で切り出し、それをpFUSEN (invivogen製)のEcoRVサイトに平滑クローニングすれば、インフレームでFc融合タンパク質が出来上がることになります。つまり、 Fc-kozak sequence-CPD-TM-ECD となります。 これを正月前にどうにか作って、COS1に一過性導入し、3日後の培養上清をプロテインAカラムで精製し、三が日以内に結合実験（フローサイトメトリー）が出来ればと思っています。それで”感触”が掴めれば本番であるFc-ECDのために年始にプライマーを注文し、1月中にどっしり構えて手堅いデータを出せればと考えています。 大変個人的な理由ですが、年始までプライマー注文を悠長に待っていられません。 そこで質問なのですが、 ”Fc”-kozak sequence-CPD-TM-ECD はきちんと細胞外へ分泌されるでしょうか？ もちろんFcがN末にあるので、Igkのリーダー配列が分泌配列として機能しますが、この全長にはCPDやTMまでも含まれています。これらが細胞内や細胞膜に貯留する懸念になりますでしょうか？ このデザインで論文に出そうとは考えていません。 ただ、1日でも早く感触を掴みたいために、今ある材料で何が出来るかを考えた結果、上記のようなアイデアが浮かびました。 どうか、ご教示いただけますと幸いです。

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