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(無題) 削除/引用 No.7505-6 - 2018/12/25 (火) 18:52:03 - レンチ 3種類のベクターのタイターや、細胞のウイルスの入りにくさにもよるのでしょうけれども、どれも感染させやすいものならば一度にすべて感染させればよいのではないでしょうか。 一番タイターの低い遺伝子を最初に感染させて、セレクションをかけた後に残りを感染させるという方法を私なら取ると思います。

(無題) 削除/引用 No.7505-5 - 2018/12/25 (火) 03:21:15 - tomo 横からすみません。 私は3つの異なる遺伝子をある細胞に発現予定です。 それぞれピューロマイシン、ハイグロハイシン、ブラストサイジン抵抗性遺伝子を持っています。 まず各薬剤の最小濃度を今決めているところですが、不安なので、一つ一つ感染予定です。 ただ、もしマルチプルインフェクションが可能であれば、2つないし3つ一度に感染させ、2つないし3つの抗生剤をどかんと加えれば時短が可能です。 みなさんはどうされるといいと思われますか？

(無題) 削除/引用 No.7505-4 - 2018/12/24 (月) 15:31:49 - asan ちゃんとしたタイターの測定方法はすでに回答の通りです。 ただ、通常MOI=0.5-0.2付近で導入するというのは、意図したいことは確実にシングルインテグレーションしたプール等の作製が目的なので、それを検証できる条件であれば厳密な測定方法を選ぶとかしなくてもいいと思います。当然ですが、MOI=1でいれたからといって全ての細胞の1個ずつ1コピーの遺伝子が入るという状況を作るのは不可能ですからね。 psPAX2、pMD2.Gのレシオは人それぞれでだいたい導入したい遺伝子の半量ずつ前後だと思いますが、例えばaddgeneのレンチプロトールの場所に従ってやればいいと思います。その際、PEIを使ったトランスフェクションはコスト的にも良いのでリン酸カルシウムより簡便なのでオススメです。

(無題) 削除/引用 No.7505-3 - 2018/12/22 (土) 05:26:54 - X Addgeneのサイトを見ると、Lenti-X 293T（蛍光マーカー）やA549（薬剤耐性コロニー）を用いたタイター測定プロトコールが出ているみたいですよ。プロトコールでどの細胞を使うか推奨されてませんか？　蛍光マーカーのFACS検出でタイター測定する場合は、ウイルス液を希釈して、陽性細胞が10-20%くらいになる条件で測定した方が良いです（陽性細胞率が高くなると、マルチコピーで感染した細胞が増えて、タイターを過小評価する事になります）。 transfer vector : psPAX2 : pMD2.G = 3:2:1 でやっていますが、1:1:1でも大差ない印象です。

(無題) 削除/引用 No.7505-2 - 2018/12/21 (金) 19:43:25 - レンチ 感染させたい細胞でMOI=2であれば、その細胞を使ってウイルスのタイターを測ります。 タイターの測定は私の場合、ウイルスベクターに蛍光タンパク質が 入っているので、蛍光を持った細胞をウイルスが感染した細胞として数えて行っています。 具体的には ウイルスを293Tで作らせ、ウイルス液の希釈系列を作る。 それを一定数の感染させたい細胞に実際に感染させる。 感染3日後に蛍光陽性の細胞をFACSで数える。 多重感染を考慮して、蛍光陽性細胞が20%以下ぐらいになるような ウイルスの希釈率をタイターの計算に使います。 感染させた細胞数と蛍光陽性細胞の割合及び希釈率からウイルス液1mlで いくつの細胞に感染するか(TU/ml)が求まります。 例えばTU/ml=10^9であるとすると希釈されていないウイルス液1mLで10^9の細胞に感染します。 10^9の細胞を播種すれば1細胞あたり1個のウイルスが感染することになりMOI=1となります。0.2であればこの場合5*10^9の細胞をまくかウイルス液を5倍希釈して10^9の細胞に感染させればいいはずです。 psPAX2、pMD2.Gは使ったことないのでいい比率は分かりませんが使うトランスフェクション試薬に例なり参考文献が出ているのではないでしょうか。 psPAX2は日本だとバイオセーフティーレベル3以上の施設でのみ使えると思うのですがそのようなところでタイターを測っている人が周りにいないものなのでしょうか？海外でしたら分かりませんが。

レンチウイルスタイター（MOI＝0.2） 削除/引用 No.7505-1 - 2018/12/21 (金) 09:52:15 - ウイルスタイター アッドジーンからレンチウイルスベクターを購入しましたが、そのプロトコルにはpsPAX2とpMD2.Gを合わせた3つを293Tに一過性導入し、感染させたい細胞へはMOI＝0.2で感染せよとあります。 MOI＝0.2にするためには、ウイルスタイターを測定する必要があると思うのですが、これは具体的にどのように行えばいいのでしょうか？ また、ウイルス用プラスミド、psPAX2、pMD2.Gの比率はみなさんいかほどで行なっていますでしょうか？ 情報をシェアしていただけるとあいがたいです。 よろしくお願いします。

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