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(無題) 削除/引用 No.7501-5 - 2018/12/21 (金) 10:11:43 - おお WBなどで使うためにTotal lysateをとるなら、１０mgにたいして５００ｕl のRIPA bufferを推奨するプロトコールもあります。細胞がぎっしりの組織では１００mgだとおそらくTotal lysateをつくろうとすると、１０mgぐらいの蛋白が溶出されるかなと勝手に想像していますが、これに対してバッファーが１mlなら相当高い蛋白濃度になりちゃんと溶出できているのかふあんです。実際に遠心後のペレットにLysis bufferを加えると相当の蛋白が更に溶出されることもあります。 ただ、１００mgに１mlぐらいというプロトコールもあるし、もちろん組織にもよるでしょう。 そうでなくて特定の酵素の活性を図るとかなら、１００mgにたいして１mlでもできるのかもしれません。過去の文献をさがすとか、予備実験が必要かもしれません。 また場合によってはどうしても抽出液の容量が減らしたいときは、たとえば５００ｕlで抽出して遠心後ペレットにもう一度５００ｕlをくわえてHomogenizeして遠心、さいしょの抽出液と合わせるというてもとれるとおもいます。 https://www.ptglab.com/media/2724/protocols-for-web_lysate-preparation_v3.pdf https://www.gbiosciences.com/image/pdfs/protocol/786-489_protocol.pdf

(無題) 削除/引用 No.7501-4 - 2018/12/21 (金) 09:24:20 - frgvbhj これがスタンダードとか決まりがあるという訳ではないですが、5ないし10%ホモジネート（すなわち　組織体積（重量）：液量　が2:8ないし1:9くらいの割合）がいいかんじでホモジナイズできて、蛋白質濃度も希釈されすぎたりしないです。100mgならば1.5ml容量のマイクロチューブで、専用のディズポのペッスル（先端がチューブにフィットするように円錐形になってるプラスチックのやつ）で行なってもよいかもしれません。本来は手でおこなうのですが、最近は電動のものもあります。ホモジナイしにくければはじめ少量の液量である程度つぶしてから、液をたしてもいいです。

(無題) 削除/引用 No.7501-3 - 2018/12/21 (金) 07:35:45 - レンチン 10ml用のホモジナイザーで2-5mlのバッファーでホモジナイズすればいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7501-2 - 2018/12/21 (金) 04:52:48 - おお １mlでも潰せるとは思うけど、目的のものがちゃんと抽出されるかどうかは違う次元の問題だし、ものによっても違うんじゃないかな。

ホモジナイザーのサイズと液量 削除/引用 No.7501-1 - 2018/12/20 (木) 11:25:16 - つん ガラス製のダウンス型ホモジナイザーを使って動物の組織をすりつぶす場合、ホモジナイザーのサイズとバッファー量はどのくらいが最適なのかご教示いただきたいです。 組織は100mg程度です。 10mLおよび1mL用のホモジナイザーを持っています。 10mLサイズだと大きすぎる気がしますが、1mLでは小さいような・・・。 ホモジの上清を測定に使いたいので、液量はあまり増やさずに組織をきちんとすりつぶしたいです。 アドバイスをお願いします。

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