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タンパク質の局在と活性について トピック削除
No.7490-TOPIC - 2018/12/17 (月) 17:32:27 - タンパク難しすぎます
いつもお世話になっております。

本題ですが、小胞体シグナルを有する分泌タンパク質を細胞内で発現させたいと考え、小胞体シグナルを除いた残りの塩基配列をコードするプラスミドを作製しました。そのプラスミドをマウスがん細胞株にLipofectamine3000でトランスフェクションし、24時間後に活性を確認しました。すると、なぜか培養上清では活性が見られますが、逆に細胞内では全く活性が見られないという結果が得られました。プラスミドの塩基配列は確認済みで、シグナルペプチドが省かれていることは分かっています。そこでお聞きしたいのは、

1.元々分泌型であるタンパク質を細胞内（細胞質でも、ミトコンドリアでも、核でも）で発現させることは不可能なのか

2.逆に細胞内で働くタンパク質は分泌型にさせようとすると活性を失うのか

3.1や2が正しいとしたら、それは何が原因なのか

です。私は、小胞体シグナルを除けば細胞質でタンパク質が発現するものだと考えていましたし、何かの本でそのように読んだ記憶があるため、今回の結果が衝撃的でした。ご指導いただければと思います。宜しくお願い致します。
　
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全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

返信ありがとうございます 解決済み 削除/引用
No.7490-11 - 2018/12/21 (金) 06:48:04 - タンパク難しすぎます
>おお様
トポロジーに関する研究もまだまだ分かっていないことが多いようですね。いくつか作製し、良さそうなものを使うことにします。重ねての質問にも対応していただき、非常に助かりました。

皆様ありがとうございました。この質問はここで〆させていただきます。また質問することがあるかもしれませんが、その際は宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用
No.7490-10 - 2018/12/21 (金) 04:48:53 - おお
>TypeTの場合、Cleaved signal+細胞外領域+stop transfer sequence+細胞質領域というタンパク質になると思いますが、この中の細胞外領域に存在するsequenceを少なくしてしまうと、TypeTのタンパク質ではなくなってしまうのか調べてもよくわかりません。

現在のわかっている範囲では膜に近接するアミノ酸の電荷が影響するだろうけど、それ以外の細胞外の配列の関与は見つかってないのだと思います。

すなわち、現在の知見からの理屈では膜に近接するアミノ酸が残っていれば大丈夫だということになりますが、わかってないことがあるかもしれませんのでやってみないとわからないだろうと思います。

削ってないのと削ったもの、あるいは複数の遺伝子でやってみてワークするものを選ぶことになるかもしれません。細胞外ドメインで活性に必須のアミノ酸を潰して機能を持っていないものを作るというのもありなのかもしれません。

返信ありがとうございます 削除/引用
No.7490-9 - 2018/12/20 (木) 13:43:37 - タンパク難しすぎます
>おお様
私の目的のためにはType1の膜タンパク質のC末端に目的タンパク質をつければ良さそうということですね。論文もありがとうございます。熟読いたします。
もう一つだけお聞きしたいことがあります。TypeT膜貫通型タンパク質のC末端を目的タンパクに置き換える際に、N末端側は全くいじらないほうがベターでしょうか。TypeTの場合、Cleaved signal+細胞外領域+stop transfer sequence+細胞質領域というタンパク質になると思いますが、この中の細胞外領域に存在するsequenceを少なくしてしまうと、TypeTのタンパク質ではなくなってしまうのか調べてもよくわかりません。可能ならば細胞外領域に不要なタンパク断片をあまり残したくないと考えているため、Cleaved signal+少数のアミノ酸+stop transfer sequence+細胞質領域というタンパク質に改変しようかと考えています。このような配列に変えてもタンパク質はTypeT型を保つのかは、実際にやってみるしかないのでしょうか。それとも、このような改変をしてもTypeTは保たれるのでしょうか。
何度も質問をしてしまい申し訳ありませんが、ご指導いただけると幸いです。

(無題) 削除/引用
No.7490-8 - 2018/12/20 (木) 07:19:00 - おお
>また、膜結合型というのは、脂質二重膜の細胞質側に目的タンパク質を結合させるという解釈で正しいでしょうか。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014579301027120

Cytoplasmicに目的の蛋白が来るようにするなら、Type Iの膜タンパク質のC末に融合。その膜タンパクのC末を削って入れ替えできるかもしれませんが、膜近傍のアミノ酸はトポロジーに重要と言われていますので、そこは残しておいたほうがいい。

ER内や細胞表面に提示されるようにするなら、Type IIの膜タンパク質のC末。

細かい局在（ERやゴルジ、細胞膜など）は融合した蛋白によるかもしれないし、融合によって局在に関わる部分があまり機能しなくなるかもしれないけど、膜にアンカリングされた状態は保てると思います。

そのたGPIアンカーというのもあるから調べてみるといいでしょう。

またCytoplasmincで膜にアンカリングするメカニズムとしてファルネシル化などがあります。

返信が遅くなり申し訳ありません 削除/引用
No.7490-7 - 2018/12/19 (水) 23:21:11 - タンパク難しすぎます
皆様多くの返信をありがとうございます。

>コンピテント大腸菌様
やはり元来分泌型のタンパク質を細胞内に留めるのは単純な話ではなさそうですね。また、私の表現が悪く、小胞体シグナルはER retention signalではなく、分泌型のタンパク質になるためのシグナル配列のことです。KDEL配列は付けていません。誤解を生む表現をして、大変申し訳ありません。

>おお様
やはり不可能ではないのですね。タンパク質が局在によって同一かについては、先入観から同一のものだと考えていましたが、確かに考える必要がありますね。貴重なご意見ありがとうございます。
また、膜結合型というのは、脂質二重膜の細胞質側に目的タンパク質を結合させるという解釈で正しいでしょうか。まさに今そのような実験を行おうかと考えていたところですが、なかなかその方法が分かりません。ウイルスが有するGAGタンパクを用いる方法以外で、細胞質側のリン脂質に結合させる方法はあるのでしょうか。2回膜貫通型の配列にして細胞の内側に詰め込むのは１つの手かと考えていますが、どのタイプのトポロジーになるか等、難しいような気もしています。

>み様
細胞全体でどこにも存在していないことを確認しています。というのも、細胞lysate全体でそのタンパク質の活性が見られないことを確認したためです(このたんぱく質はlysis bufferには安定であることは知られています）。そのため、細胞質でこのたんぱく質を発現させようとすると、何らかの原因で活性が無いことがわかり、疑問に思いました。

(無題) 削除/引用
No.7490-6 - 2018/12/18 (火) 08:40:12 - み
小胞体シグナルを除いたと書いているけど小胞体内には本当に入っていないのですか？免染すればわかりますよね。

(無題) 削除/引用
No.7490-5 - 2018/12/18 (火) 03:09:22 - おお
>[Re:1] タンパク難しすぎますさんは書きました :
> いつもお世話になっております。

>
> 1.元々分泌型であるタンパク質を細胞内（細胞質でも、ミトコンドリアでも、核でも）で発現させることは不可能なのか

不可能ではないです。局在に関係するアミノ酸配列を潰したり加えたりするだろうと思うので、その違いをもってしても同一というかという視点はあるかもしれません。


>
> 2.逆に細胞内で働くタンパク質は分泌型にさせようとすると活性を失うのか

細胞内というのがEndosomeなども含むのかよくわかりませんが、、、

局在が変わると環境がかわります。pH、酸化還元的環境など。またその蛋白において他のポリペプチドの何らかの助けがあるとき、局在がちがうとそういう助けがありません・


膜結合型にすれば分泌はされなくなると思いますがどうでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.7490-4 - 2018/12/17 (月) 22:40:16 - コンピテント大腸菌
1.元々分泌型であるタンパク質を細胞内（細胞質でも、ミトコンドリアでも、核でも）で発現させることは不可能なのか

不可能なことはないと思います。
ただ元々分泌タンパク質ですと、細胞質等で発現させるには深く考える必要がありそうです。

2.逆に細胞内で働くタンパク質は分泌型にさせようとすると活性を失うのか

あり得ると思います。

3.1や2が正しいとしたら、それは何が原因なのか

pHももちろんそうでしょう。

です。私は、小胞体シグナルを除けば細胞質でタンパク質が発現するものだと考えていましたし、何かの本でそのように読んだ記憶があるため、今回の結果が衝撃的でした。ご指導いただければと思います。宜しくお願い致します。

そんなことはないと思います。
一般的に分泌タンパク質からKDEL配列を除けば、より多く分泌されると思います。
KDEL配列は小胞体貯留シグナルなので、それがなければよりスムーズに分泌されると考えて差し支えないのではないでしょうか。

返信ありがとうございます 削除/引用
No.7490-3 - 2018/12/17 (月) 21:19:44 - タンパク難しすぎます
Tracker様

返信いただきありがとうございます。

このたんぱく質の糖鎖が熱安定性に関与しているという論文は読んだことがありますが、熱安定性だけでなく機能にも関係している可能性は確かにありますね。自分に無い視点でした。ありがとうございます。

フォールディングについては私も疑っていますが、フォールディングについてあまり詳しくないため、分泌タンパク質と細胞内タンパク質でフォールディングのシステムが異なるのか否かもよく分かっていません。もう一度勉強してみます。

(無題) 削除/引用
No.7490-2 - 2018/12/17 (月) 18:31:49 - Tracker
CalnexinとかCalreticulinみたいな小胞体シャペロンがフォールディングに必要とか
糖鎖があるならそれもフォールディングとか活性に必要とか
色々あると思いますがそのタンパク質の性質を考えてみてはどうでしょう

タンパク質の局在と活性について 削除/引用
No.7490-1 - 2018/12/17 (月) 17:32:27 - タンパク難しすぎます
いつもお世話になっております。

本題ですが、小胞体シグナルを有する分泌タンパク質を細胞内で発現させたいと考え、小胞体シグナルを除いた残りの塩基配列をコードするプラスミドを作製しました。そのプラスミドをマウスがん細胞株にLipofectamine3000でトランスフェクションし、24時間後に活性を確認しました。すると、なぜか培養上清では活性が見られますが、逆に細胞内では全く活性が見られないという結果が得られました。プラスミドの塩基配列は確認済みで、シグナルペプチドが省かれていることは分かっています。そこでお聞きしたいのは、

1.元々分泌型であるタンパク質を細胞内（細胞質でも、ミトコンドリアでも、核でも）で発現させることは不可能なのか

2.逆に細胞内で働くタンパク質は分泌型にさせようとすると活性を失うのか

3.1や2が正しいとしたら、それは何が原因なのか

です。私は、小胞体シグナルを除けば細胞質でタンパク質が発現するものだと考えていましたし、何かの本でそのように読んだ記憶があるため、今回の結果が衝撃的でした。ご指導いただければと思います。宜しくお願い致します。
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