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マウス２型肺胞上皮細胞の初代培養について トピック削除
No.7481-TOPIC - 2018/12/13 (木) 15:18:38 - きりゅ
こんにちは。初めて投稿させていただきます。
マウスから２型肺胞上皮細胞を単離して培養したいのですが、生存率が低く、何度やっても80%以上が定着せず死んでしまいます。

方法としては簡潔に書くと心臓から生食を流し血を洗い流し、肺を単離後に気管から0.25%トリプシンを流し込み消化、その後切り刻みFBS,DNaseを加えた後4分程振とう温浴、100,40μmのフィルターに通した後パーコールにて分離、分離後にwash、培地にまくという形です。

あまりお金をかけずにやりたいので、できればFACSは使いたくないです。何か注意するべき点などありましたら教えていただければ幸いです。
消化後の肺がでろでろになっているので消化のし過ぎかと思い、トリプシンの濃度を変えたり消化の時間を変えたりしましたがうまくいきませんでした。

長文乱文で申し訳ありませんがご教授お願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.7481-5 - 2018/12/19 (水) 04:58:13 - AT2
分離直後の２型肺胞上皮細胞の割合は確認しておいた方が良いと思います。例えば、分離直後は２０％くらいだった２型肺胞上皮細胞が、培養で生き残って生細胞の半分くらいになるのであれば、培養の改善よりも、２型細胞の分離純度をあげる事を考える方が理にかないます。一方、もし分離直後が８０％で、培養によりそのほとんどが死んでしまうのであれば、培養法の改善を考える方が良いと思います。

ちなみに、培養条件はどんな感じでしょう？　下記の論文など、ラットでエラスターゼ処理なので、トピ主さんの条件とは異なりますが、経気道の酵素処理で２型細胞を分離してます。ソートなしだと３０−５０％の純度で、培養はマトリジェル・コートのトランスウェル上、培地はKGF＋１％血清（ラット）＋ 8Br-cAMPのようです。全部フォローすると高額になるので現実的ではないかもしれませんが、部分的に取り入れても良いかもしれません。ご参考まで。

ttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3971988/

(無題) 削除/引用
No.7481-4 - 2018/12/17 (月) 14:31:23 - きりゅ
返信ありがとうございます。

＞ema様
dispaseでこのやり方でやっている論文が無かったのでdispaseは使っていませんでしたが、もう少し検討してみようと思います。

＞AT2様
最近の論文を見ると大体が脱血後そのままミンスしているので、おそらくFACSを使う方法だとそのような処理方法でいいのだろうなと勝手に解釈していました。

培養から２日後に染色を行っているのですが、ほとんどが死んでしまうので参考にならないとは思います…。一応その染色では生細胞のうち２型の割合は半分くらいだと思います。
分離直後は死細胞は10%位なのですが、一日後に観察するときには死んでる細胞が多くみられるといった感じです。
分離直後は２型細胞と他の細胞の区別がつかないので、もしかしたらその時点で２型細胞の割合が少ないのかもしれません…。

やはりFACSのほうが良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.7481-3 - 2018/12/16 (日) 01:01:06 - AT2
昔ながらの方法（collagenase + DNase +FBS in RPMI media）で、刻んだ肺組織から２型上皮細胞を分離してますが、経気道での酵素処理はやっていません。FACSソートなしでは、純度を上げるのが厳しいと思うのですが、トリプシン処理・フィルター・パーコールで回収した細胞のうち、２型上皮細胞の割合はどれくらいでしょう？

生存率が低いというのが、分離直後の状態なのか、あるいは元々生きていた細胞が培養中に死んでしまうのかによって、対策が変わります。パーコールで死細胞は除けてますか？

dispase 削除/引用
No.7481-2 - 2018/12/14 (金) 11:34:22 - ema
トリプシンではなくLiberaseもしくはdispaseでやっています。
https://www.sigmaaldrich.com/japan/lifescience/roche/cell-biology/collagenase_and_liberase-selection_celltype.html

マウス２型肺胞上皮細胞の初代培養について 削除/引用
No.7481-1 - 2018/12/13 (木) 15:18:38 - きりゅ
こんにちは。初めて投稿させていただきます。
マウスから２型肺胞上皮細胞を単離して培養したいのですが、生存率が低く、何度やっても80%以上が定着せず死んでしまいます。

方法としては簡潔に書くと心臓から生食を流し血を洗い流し、肺を単離後に気管から0.25%トリプシンを流し込み消化、その後切り刻みFBS,DNaseを加えた後4分程振とう温浴、100,40μmのフィルターに通した後パーコールにて分離、分離後にwash、培地にまくという形です。

あまりお金をかけずにやりたいので、できればFACSは使いたくないです。何か注意するべき点などありましたら教えていただければ幸いです。
消化後の肺がでろでろになっているので消化のし過ぎかと思い、トリプシンの濃度を変えたり消化の時間を変えたりしましたがうまくいきませんでした。

長文乱文で申し訳ありませんがご教授お願い致します。
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