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(無題) 削除/引用 No.7478-12 - 2018/12/14 (金) 16:40:23 - おお よくわからんのだけど、バンド切り出して配列決めるという作業が実験を進めるのどれほど有益なんだろうか？

(無題) 削除/引用 No.7478-11 - 2018/12/13 (木) 17:38:50 - おお ネガコンはできれば何かたんぱく質を発現させて（GFPとかGSTとか）精製したほうがいいでしょうけど、なければBSAなどを同じタンパク量加えるのも手かもしれません（BSAで影響が出ないなら）。

(無題) 削除/引用 No.7478-10 - 2018/12/13 (木) 17:30:50 - おお https://zenodo.org/record/1287852#.XBIYUcJ7mUk

(無題) 削除/引用 No.7478-9 - 2018/12/13 (木) 17:08:18 - おお ポリクロでもペプチドを使って作っていたらそのタンパクのごく一部分にしか反応しないし、ペプチドでなくても一部の配列でリコンビナントを作っていたらリコンビナントにない配列は反応しないし、ポリクロがどうやって作られたか確かめるべきです。 Hisタグで精製しているならそのたんぱく質がマルチマーを形成するとかアグッテいるのでなければ大まかに短いフラグメントはHisタグからどれくらいの所までの断片かわかるし、その上でその断片に抗体が認識する可能性がある部分があるかラフには判断できるでしょう。 ＞しかし洗浄バッファー（溶出バッファーを４倍希釈したもの）で十分量流したあとでもカラムにひっついているタンパクというのはそうそうあるものでしょうか？ Hisタグは確かに非特異を多く拾いますので、CBBで検出されたバンドのすべてでなくても多くのバンドが共雑物かとおもいます。わたしはニッケルカラムで精製した後はイオン交換などでさらに精製することがおおいです。 ニッケルカラムでというなら保障はしませんが、得られたタンパク量に近いキャパになるようにニッケルレジンをよういしてのんすぺよりHisタグが優先して結合できるような環境にしてさらに精製するとましになるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7478-8 - 2018/12/13 (木) 17:01:39 - WB a様 ありがとうございます。 そう考えるとhisタグ精製タンパクの機能解析はなかなか難しいですね。培養細胞に加えることで変化を調べているのですが、コントロールとしては遺伝子導入をしていないバキュロの上清をhisタグ精製したもの、ということになりますでしょうか？そうするとそもそもhisタグカラムに反応するものが無いと考えていましたが、何かしらのバキュロ由来因子が吸着するんですかね。 一方で同じバキュロでも、違う遺伝子を導入したものでは夾雑バンドが無かったりします。これが悩みの種なのですが、バキュロ由来のものであれば遺伝子を変えても共通してバンドがみられるのではないかと。。

(無題) 削除/引用 No.7478-7 - 2018/12/13 (木) 14:03:57 - a Hisタグでしたら非特異結合が多いので、どうしても夾雑は残ります。 かつ、ポリクロを使用されているのでしたら 個人的にはほぼ間違いなくCBBで見えた他のバンドは夾雑物かと思います。

(無題) 削除/引用 No.7478-6 - 2018/12/13 (木) 13:58:39 - WB a様 すでにポリクロを使用していました。バンドを切り出す必要があるようですね。。 おお様 説明不足ですいません。精製はHisタグで行っています。そもそも精製後に複数バンドが出ているため夾雑物か否かで困惑しております。バキュロウイルスで分泌因子を発現させました。洗浄を十分量行って溶出してもいくつかのバンドが残っているため、目的タンパクなのか、またはウイルス由来サイトカイン？等の可能性を考えています。しかし洗浄バッファー（溶出バッファーを４倍希釈したもの）で十分量流したあとでもカラムにひっついているタンパクというのはそうそうあるものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7478-5 - 2018/12/13 (木) 11:22:42 - おお 例えばその抗体がその蛋白の真ん中を認識し、その蛋白が５０kDaなら、４０kDaの断片は抗体に反応しますよね。 全長も含まれているのなら更に精製すればいいんじゃないでしょうか？ でいまのサンプルはどのように精製したのですか？

(無題) 削除/引用 No.7478-4 - 2018/12/13 (木) 11:20:06 - a ・モノクロじゃなくてポリクロを使う ・バンド切り出して配列確認する とか

(無題) 削除/引用 No.7478-3 - 2018/12/13 (木) 08:59:58 - WB qq様 早速のご回答ありがとうございます。 バンドは単一でなく複数本認められています。

(無題) 削除/引用 No.7478-2 - 2018/12/13 (木) 08:53:47 - qq ＞WBでシグナルが得られないがCBBで染色されるバンドがあります。 単一のバンドであれば、PMFすればよいのですよ。

WBでタンパク全体を見る 削除/引用 No.7478-1 - 2018/12/13 (木) 08:45:24 - WB WBで特定のタンパクの発現の有無を見る場合、全長がしっかりとつくられているのかどうかはどうやって調べればよいのでしょうか？ 全長を合成したタンパクをWBすることで特定領域（抗体が反応する部分）は確認できますが、断片化されていたりする場合は、それらの部分をどうやって確認したらいいのでしょうか？ WBでシグナルが得られないがCBBで染色されるバンドがあります。目的タンパクの一部であるのか、または夾雑物であるのかを調べたいです。

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