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免疫染色（蛍光抗体法）での自家蛍光 トピック削除
No.7473-TOPIC - 2018/12/10 (月) 22:12:58 - YI
ラット腎組織のFFPE切片を用い蛍光抗体法での免疫染色を行っております。
糸球体への圧負荷等を考え潅流固定は行わず、腎組織をスライスした後にホルマリン固定。染色の際の二次抗体は、Alexa Fluor 488を使用。
糸球体内での標的タンパク沈着の有無を確認したいのですが、糸球体のみではなく、尿細管や血管内も強く発光してしまいました。当初は抗体やバックグラウンドの問題と考え、抗体の濃度やインキュベート時間・ブロッキング時間・Alexa Fluor 488→555への変更などの条件の調整、同タンパクを標的とする他の一次抗体を用いての検討を行いましたが、同様に発光を認め、なかなか抑えることができませんでした。
その際、ネガティブコントロールとして試しに一次抗体も二次抗体も使用しない状態（抗体希釈液として使用しているのPBS-Tween液のみを使用）でも同様に行ってみたところ、やはり尿細管や血管内での発光を認めました。

これは血液による自家蛍光と考えてよいのでしょうか。その場合、血管内や血流が豊富な部位のみではなく尿細管でも自家蛍光を認めることがあるのでしょうか。
また、これが自家蛍光であるのであれば、それを抑えるためにはどのような方法がございますでしょうか。
長文・乱文で申し訳ございませんが、御教授頂けましたら幸いです。
　
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No.7473-4 - 2018/12/12 (水) 10:04:03 - 1
尿細管上皮は原尿中に漏れ出た血漿蛋白質などいろんなものを再吸収します。とくに糖化修飾アルブミンなどの異常なものを選択的に取り込む受容体もあるようですので、そうしたものが上皮細胞内に蓄積することがあるかもしれません。これらは、自家蛍光の原因になるような化学構造をもつ修飾体を有する場合ことがあるので、これらが自家蛍光の原因になる場合はあるとおもいます。ラットでは系統によっては比較的若いうちから、しばしば腎臓に異常がみられることがあるのでそうしたことも含めて検討されることを勧めます。

特に蛍光でみなくてはならない特別な理由がないならば、DABとかの発色法で検出すれば、自家蛍光の問題は回避できるとおもいます。いまは良いkitも市販されており、良質の抗体を用いて適切な染色がおこなわれれば、蛍光とくらべて決してみおとりしないきれいな画像が得られますし、ヘマトキシリンによる対比染色することで位置情報も蛍光よりもわかりやすいですし、プレパラートで永久標本が作れます。蛍光と違う主な点として、免疫染色後にヘマトキシリン染色→水洗で脱色→エタノールで脱水→キシレンで透徹→封入→撮影の工程がありますので注意してください。具体的な事は成書を参照ください。

(無題) 削除/引用
No.7473-3 - 2018/12/11 (火) 07:21:44 - mm
Vector Laboratoriesから
Vector® TrueVIEW™ Autofluorescence Quenching Kit
というのが、出ています。私たちはhuman kidney paraffin sectionsで染めましたが、自家傾向もしっかり抑えられました。

(無題) 削除/引用
No.7473-2 - 2018/12/11 (火) 00:22:23 - Tracker
そのラットは腎臓系の病態モデルか何かですか？尿細管内腔に結晶的なものが溜まるとか。
まあでも染めずに光っちゃうなら自家蛍光なんでしょう。
より長波長側の蛍光色素(Alexa647とか)は生物試料の自家蛍光とは被りにくいと言われていたりしますがどうでしょう。
いま問題とされている自家蛍光の性質にもよると思うのでとりあえずレーザー当ててどのくらい光るか見てみては？

免疫染色（蛍光抗体法）での自家蛍光 削除/引用
No.7473-1 - 2018/12/10 (月) 22:12:58 - YI
ラット腎組織のFFPE切片を用い蛍光抗体法での免疫染色を行っております。
糸球体への圧負荷等を考え潅流固定は行わず、腎組織をスライスした後にホルマリン固定。染色の際の二次抗体は、Alexa Fluor 488を使用。
糸球体内での標的タンパク沈着の有無を確認したいのですが、糸球体のみではなく、尿細管や血管内も強く発光してしまいました。当初は抗体やバックグラウンドの問題と考え、抗体の濃度やインキュベート時間・ブロッキング時間・Alexa Fluor 488→555への変更などの条件の調整、同タンパクを標的とする他の一次抗体を用いての検討を行いましたが、同様に発光を認め、なかなか抑えることができませんでした。
その際、ネガティブコントロールとして試しに一次抗体も二次抗体も使用しない状態（抗体希釈液として使用しているのPBS-Tween液のみを使用）でも同様に行ってみたところ、やはり尿細管や血管内での発光を認めました。

これは血液による自家蛍光と考えてよいのでしょうか。その場合、血管内や血流が豊富な部位のみではなく尿細管でも自家蛍光を認めることがあるのでしょうか。
また、これが自家蛍光であるのであれば、それを抑えるためにはどのような方法がございますでしょうか。
長文・乱文で申し訳ございませんが、御教授頂けましたら幸いです。
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