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TRIzolを用いたRNA抽出 washのステップ トピック削除
No.746-TOPIC - 2012/07/12 (木) 00:08:40 - wash
いつもお世話になっています。

TRIzolを使って培養細胞からのRNA抽出をしています。
RNA washのステップに関して2つ質問があります。


・75%エタノールを冷やしておくかどうか
washに使う75%エタノールですが、過去に所属・関係した2つのラボでは-20度に冷やした75%エタノールを使っていました。
今いるラボでは常温の75%エタノールを使っています。
メーカーのマニュアルには特にエタノールを冷やすというような記載はないのですが、みなさんは冷やした物を使っていますでしょうか、それとも常温で使用されてますか。


・遠心の強さ
メーカーのマニュアルには at no more than 7500xg for 5minと書かれているのは承知してますが、一番最初に教わったらラボでは卓上遠心機の最高回転15000rpm(約21000rcf)で遠心するようにと教わり、今までもそのようにしています。
それでRNAの回収に大きなトラブルは感じていません。
ネットで調べたプロトコールでは、メーカーの記載に従い7500xg以下で遠心としているのが多いように思いますが、「最高回転」(機種によるんでしょうが)とか、15000xg、20000xgで遠心するように、との記載も見受けられます。
皆様のラボではどうされてますでしょうか。
また高速で遠心した場合、どういった不都合が考えられますでしょうか。

メーカーに問い合わせればいいでしょうが、実際のラボでどういうふうにされてるのか疑問に思い、ここに投稿させてもらいました。
よろしくお願いします。
 
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(無題) 削除/引用
No.746-11 - 2012/07/15 (日) 22:24:01 - wash
コメントをくださった皆様、ありがとうございます。

質問への回答のみならず、実験をする際の心構え、質問する際の心構えなど、色々ご指導くださりありがとうございます。


質問させてもらった2点ですが、

・75%エタノールを冷やしておくかどうか
→冷エタノールを使う必然性はなく、むしろ冷エタノールで塩の除去が悪くなる可能性がある、とのことですので、以後は常温エタノールを使うことを考えます。
 一度、自ら冷エタノール、常温エタノールでの比較検討も考えたいと思います。

・遠心の強さ
→今まで通り遠心は最高回転で行おうかと思いますが、これも一度自ら比較検討したいと思います。


ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.746-10 - 2012/07/15 (日) 21:14:48 - Harmonia
ぼくはアンチキット派です。
その立場ですが、キットを使うこともあります。
時間短縮とか手間の削減とか。

その立場ではあるものの、キットを使うときは、よほどそのキットのコンテンツを知っているのでなければ、説明書どおりにやります。
仮に結果に満足しない場合、マニュアルどおりでなければ、メーカーは親身には対応してくれませんので。

それを踏まえたうえで、自身の経験値を上げたいというのなら、No.746-5 となりさんのおっしゃるように、自分で確かめ、自分で納得するのが良いでしょう。

外からあなたが得える情報は、上記の次の順番だと思います。
あなたが得た情報は、あなたのラボの中の問題であったり、見つけたプロトコールを書いた方の問題なので、「なぜキットの説明書どおりでないのか」は、ラボの方やそのように書いた方に聞くと良いでしょう。

また、問題なかったときに、「この条件でも問題なかったけど、マニュアルにはこのように書いているのはどうして?」とメーカーに聞くのも良いでしょう。
過去にクレームが発生したので修正した結果かもしれませんし、開発段階でいろいろやった結果かもしれません。


ここで聞くのも良いと思いますが、「自身のラボではこうしていて、理由はこうだけど」とか「自身のラボではこうしていて、でもラボの誰も理由を知らない」という言い方をしていただくと、より良いかも。さらに、問題を抱えているのか問題を感じていないのかも書いていただくと、良いです。

(無題) 削除/引用
No.746-9 - 2012/07/15 (日) 06:40:37 - 横からですが
APさんのようにmolecular biologyの来し方を知る方が
このような場でそのことを語るのは、私は大変良いことだと思うのです。
私もここのところ大半の実験をキットを用いるようになってしまい、
原理を必ずしも理解しないということがあったりします。
この分野に入ったときからキットに囲まれるようになった人には
ここは良い勉強の場であると思います。もちろん成書を読むことは大事なことですが。

(無題) 削除/引用
No.746-8 - 2012/07/12 (木) 14:45:34 - 通り
>まぁまぁ、そんなにきつく当たらなくても。

別にいいんですけど、
この発言によって

厳しいがもっともなことをいっている人々が、あたかも悪者であるようにしてしまい、
考えもしない質問者が改心していくことを阻害する気がします。

(無題) 削除/引用
No.746-7 - 2012/07/12 (木) 14:22:46 - TS
まぁまぁ、そんなにきつく当たらなくても。
特に1つ目の質問については、いまだに盲目的に冷エタノールを使っている人がいるのではないでしょうか。

で、他の人がおっしゃる通りですが、
冷エタだと塩が除きにくくなるので、一般的にはあまりよくない。
遠心は、液液分離ができれば問題ない。わたしは、卓上で13000rpmでやってます。

(無題) 削除/引用
No.746-6 - 2012/07/12 (木) 12:22:53 - AP
あなたも、マニュアルに従ってしか判断できないマニュアルニンゲンですか。
それぞれの手技、方法の理屈や原理を理解していれば、またそのために成書(Molecular Cloningだとかcurrent protocolsとか)や原著論文を勉強していれば、あなたの挙げているような疑問はたいてい解決すると思いますし、必要に応じてマニュアルを離れてモディファイすることも簡単でしょう。

・EtOH pptのときEtOHをフリーザーで冷却するのは古い古い(Molecular Cloning第一版以前)の慣習でした。今では特殊な場合(非常に微量の核酸を沈殿させるとか)を除き、室温でも効率は変わらないとされています。
むしろ、低温にすることで塩が溶けにくくなって、リンス、バッファー交換を妨げます。AGPC法であれば、低温で析出しやすいグアニジン塩が除きにくくなるでしょう。

・フェノール抽出の遠心は相分離できればいいので、速いぶんには構わないです。それでも遠心力を控えめにすることが多いのは、有機溶媒が入った状態では遠心管の強度が下がりクラッキングが起こる可能性があるとか(最近はディスポのチューブでもずいぶん強度がよくなりましたが)、キャップからフェノールがしみ出して撒き散らしたりすると危険だからという理由だと思います。

(無題) 削除/引用
No.746-5 - 2012/07/12 (木) 11:11:50 - となり
理屈より、自分で比較して実験してみて
自分の目的に何か影響があるのかどうかで判断すればいいでしょ?

何にどんな影響があるのかなんて、
話だけだったら、色々あるのか、いやないのか、
誰も正解はないだろうし。

>何か意味のある違いなのかどうかと疑問に思った次第です。

この文章の意味はわかりますが、
現実的にこれを知って何の意味になるのか?
よくわかりません。

amiさんが切れた? 削除/引用
No.746-4 - 2012/07/12 (木) 09:41:14 - ~
>みなさんは冷やした物を使っていますでしょうか、それとも常温で使用されてますか。
常温
冷蔵・冷凍庫は共通なので、人が触らないように実験机の下の収納部分に隠しています。

>また高速で遠心した場合、どういった不都合が考えられますでしょうか。
デメリット
・不要物も落ちる場合がある
・電気代がかかる
・遠心機の寿命が縮む
・加速減速に時間がかかる

メリット
・遠心機の回転速度の設定を変える工程が省略可能な場合がある
・遠心時間を短縮できる場合がある
・高速の遠心が必要な実験をしている人が、間違えて低速で回してしまうリスクが減る

>何か意味のある違いなのかどうかと疑問に思った次第です。
結果はこれまでに見ていますよね。
自分の用途で違いが生じるかは、自分で判断できるのでは。

(無題) 削除/引用
No.746-3 - 2012/07/12 (木) 00:33:47 - wash

早速のご返答ありがとうございます。

手順書というのは、試薬に添付してあるInstructionということでしょうか。それとも教科書、HPなどに書かれているTRIzolを用いたRNA抽出のプロトコールでしょうか。

いずれにせよ、ここに質問させてもらった意図としては、

RNA washのステップについて、メーカーのInstructionに記載されていない、また記載と反する手順が実際のラボで行われているので、それがRNAの収量・精製度をよくするために実際の現場で改良されたことなのか、それとも(冷やそうが回転速度の違いはどうでもよくて)各ラボの「都市伝説」的なものとしてやられていることなのか、を知りたい、ということです。


メーカーのInstrucionと、いろんなところに記載されているプロトコールを見比べた結果、何か意味のある違いなのかどうかと疑問に思った次第です。

その点ご了解いただければと思います。

(無題) 削除/引用
No.746-2 - 2012/07/12 (木) 00:18:23 - ami
自分で調べなよ。そんなのは手順書読んだらすぐわかる事だよ。

TRIzolを用いたRNA抽出 washのステップ 削除/引用
No.746-1 - 2012/07/12 (木) 00:08:40 - wash
いつもお世話になっています。

TRIzolを使って培養細胞からのRNA抽出をしています。
RNA washのステップに関して2つ質問があります。


・75%エタノールを冷やしておくかどうか
washに使う75%エタノールですが、過去に所属・関係した2つのラボでは-20度に冷やした75%エタノールを使っていました。
今いるラボでは常温の75%エタノールを使っています。
メーカーのマニュアルには特にエタノールを冷やすというような記載はないのですが、みなさんは冷やした物を使っていますでしょうか、それとも常温で使用されてますか。


・遠心の強さ
メーカーのマニュアルには at no more than 7500xg for 5minと書かれているのは承知してますが、一番最初に教わったらラボでは卓上遠心機の最高回転15000rpm(約21000rcf)で遠心するようにと教わり、今までもそのようにしています。
それでRNAの回収に大きなトラブルは感じていません。
ネットで調べたプロトコールでは、メーカーの記載に従い7500xg以下で遠心としているのが多いように思いますが、「最高回転」(機種によるんでしょうが)とか、15000xg、20000xgで遠心するように、との記載も見受けられます。
皆様のラボではどうされてますでしょうか。
また高速で遠心した場合、どういった不都合が考えられますでしょうか。

メーカーに問い合わせればいいでしょうが、実際のラボでどういうふうにされてるのか疑問に思い、ここに投稿させてもらいました。
よろしくお願いします。

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