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(無題) 削除/引用 No.7459-27 - 2018/12/14 (金) 15:01:41 - WInter-8 >[Re:25] unoさんは書きました : > tagごとのreviewとか、こんな論文よんでみたらいいかも > > https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17327666 > https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11856823 いくらなんでも参考にならんでしょ！ ちゃんと論文を読んでお勧めしていますか？ これらの論文はタンパク質の結晶構造において、末端タグが結晶中分子のパッキングに寄与するかどうかという論文ですよ。尚、結晶構造解析業界ではこの手の論文が結構出ているんですが、統一的な見解は得られていません。 いずれも学部4年氏の質問には全く参考になりません。 むしろ、混乱させると思います。

(無題) 削除/引用 No.7459-26 - 2018/12/11 (火) 09:20:40 - 学部4年 unoさん 文献ありがとうございます。 参考にさせていただきます！

(無題) 削除/引用 No.7459-25 - 2018/12/10 (月) 21:39:08 - uno tagごとのreviewとか、こんな論文よんでみたらいいかも https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17327666 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11856823

(無題) 削除/引用 No.7459-24 - 2018/12/10 (月) 09:21:33 - 学部4年 おおさん >結局正しい間違えとかいいわるいという判断じゃなくって、最終的は研究者当事者がきめることでなかなか立ち入れないようなきがするのです。 ご助言ありがとうございます。 研究の進め方、考え方を再考させていただきました。 私の研究は私が私の時間を使ってやるものだということを認識できました。 皆様のご提案を参考に、自分で考えて研究計画を立てたいと思います。 貴重なご提案をありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7459-23 - 2018/12/10 (月) 07:44:20 - おお 質問者をふくめ皆さん正論をいっているしあとは研究者の判断だと思うのですが、すこし付け加えさせていただきます。 分かっている機能について、タグを入れたりして影響がないか確認すしたうえでタグをいれれるか判断するというのは慎重でいろいろな研究者がやっていることと思います。 でもやはりアミノ酸配列に余分なものをつけないというのはありうる判断とおもうのです。今回はまず局在をみるということなので、その局在と既知の機能の関係はどうなのか。もしかしたら調べられてない機能があってそれをこわしてしまったら実験の解釈が出来るのかどうか。 だからといって私が提示するようなある意味変な方法でやってどうなのか。 なのでそういう事については結局正しい間違えとかいいわるいという判断じゃなくって、最終的は研究者当事者がきめることでなかなか立ち入れないようなきがするのです。 わたしだって、タグをいれて調べられている（場合によっては着目している）機能に影響がないか調べてタグを入れるかもしれませんし、一切タグを入れずに見る方法を選択するかもしれませんし、状況次第で答えを変えるだろうと思うのです。

(無題) 削除/引用 No.7459-22 - 2018/12/09 (日) 17:35:22 - 学部4年 クロロホルムさん >2012年とやや古いですがご参考までに。 repository.kulib.kyoto-u.ac.jp/dspace/bitstream/2433/193721/1/9784759813708.pdf このような方法もあるのですね！ 参加にさせていただきます。 ありがとうございます！ >PAタグはベータターン構造をとる(可能という意味かも？）のでタンパク内部に挿入された例もあるようです。 www.wako-chem.co.jp/siyaku/product/life/PA_tag/pdf/PA_TARGET.pdf 恥ずかしながらPAタグを知りませんでした。。 ありがとうございます。 検討させていただきたいと思います！

(無題) 削除/引用 No.7459-21 - 2018/12/09 (日) 11:04:33 - クロロホルム 2012年とやや古いですがご参考までに。 repository.kulib.kyoto-u.ac.jp/dspace/bitstream/2433/193721/1/9784759813708.pdf PAタグはベータターン構造をとる(可能という意味かも？）のでタンパク内部に挿入された例もあるようです。 www.wako-chem.co.jp/siyaku/product/life/PA_tag/pdf/PA_TARGET.pdf

(無題) 削除/引用 No.7459-20 - 2018/12/08 (土) 23:41:52 - 学部4年 unoさん >既にターゲットにタグ付加した結果失活してしまう、ということが確認できているならともかく、上記の理由で思いとどまっているのなら、試してみりゃいいんじゃない？ 確立されていない手法にほぼゼロから挑む（挑戦のしがいはあるかもしれないけど）よりも、コスト（費用だけでなく時間も）の面ではだいぶ良いと思うけど。 ご意見ありがとうございます。 タグの付加はもちろん検討項目にありました。 しかし、タグ等を付加せずに元のままで観察出来るようななにか都合の良い方法があれば良いなと考え、まずは皆様の知恵を拝借させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.7459-19 - 2018/12/08 (土) 18:38:58 - uno > 過去の研究で、このタンパク質のホモログにランダムミューテーションを加えて機能評価したところ、1つのアミノ酸に変異が加わった(フレームシフトとかではなく)だけで不活化してしまいました。 上記は、特に珍しいことではないのでは。 でもって、変異導入とタグの付加は違う手法だし。 > タグの付加も考えたのですが、タグを加えたことによる立体構造変化やそれに伴う機能、局在への影響を考えると、他の方法があればよいと思い質問させていただきました。 世にでている多くのタグ付加タンパク質だって、上記の影響は考慮されていたわけで。 既にターゲットにタグ付加した結果失活してしまう、ということが確認できているならともかく、上記の理由で思いとどまっているのなら、試してみりゃいいんじゃない？ 確立されていない手法にほぼゼロから挑む（挑戦のしがいはあるかもしれないけど）よりも、コスト（費用だけでなく時間も）の面ではだいぶ良いと思うけど。

(無題) 削除/引用 No.7459-18 - 2018/12/08 (土) 08:54:46 - 学部4年 クロロホルムさん >意味不明。。 C末に他者と相互作用するドメインがあるということかな？ N末のシグナルペプチド直下にタグを入れる（ただしシグナルペプチドの切断を阻害しないように）ことは検討しましたか？ 過去の研究で、このタンパク質のホモログにランダムミューテーションを加えて機能評価したところ、1つのアミノ酸に変異が加わった(フレームシフトとかではなく)だけで不活化してしまいました。 また、アミノ酸の変異箇所がN末、C末どちらでも不活化することが報告されていたので、出来るだけ構造はいじりたくないと考えています。 タグの付加も考えたのですが、タグを加えたことによる立体構造変化やそれに伴う機能、局在への影響を考えると、他の方法があればよいと思い質問させていただきました。 説明不足で申し訳ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.7459-17 - 2018/12/08 (土) 08:44:55 - 学部4年 おおさん >普通はやらない方法なのでメリット、デメリットや可能性などはよく考えて整理してから決断してください。 先輩や先生と相談して、検討してみます！ ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7459-16 - 2018/12/08 (土) 08:41:27 - おお 意味不明とまでは言えないと思いますけど。。。

(無題) 削除/引用 No.7459-15 - 2018/12/08 (土) 06:02:22 - クロロホルム > 目的タンパク質は1アミノ酸変異を加えただけでも機能を失う可能性があり、タグの付加は避けたいと考えています。 意味不明。。 C末に他者と相互作用するドメインがあるということかな？ N末のシグナルペプチド直下にタグを入れる（ただしシグナルペプチドの切断を阻害しないように）ことは検討しましたか？

(無題) 削除/引用 No.7459-14 - 2018/12/08 (土) 04:15:09 - おお >[Re:12] 学部4年さんは書きました : > おおさん > >ちょっと斬新なことを思いついたのですが、それぞれのノックアウトの細胞をネイティブの状態で違う色の蛍光をコバレントにつけたその抗体ラベルして、抗体を洗い落としてから細胞融合したらどうかな。 > > とても参考になります！ > 是非やってみたいと思います！ > ありがとうございます。 普通はやらない方法なのでメリット、デメリットや可能性などはよく考えて整理してから決断してください。

(無題) 削除/引用 No.7459-13 - 2018/12/07 (金) 20:08:20 - 学部4年 おおさん >リジンにあとで化学反応でラベルできる人工的なアミノ酸を導入するという方法はあるけどね、、、そのタンパクって細胞外ドメインで片方だけリジンがないとかある？ 勉強不足でそのような方法があるとは知りませんでした。 少し調べてみたのですが、その方法はSTELLA+ リジン標識キット等のことでしょうか？ 細胞外ドメインに片方だけリジンがあるかないかは調べてみます！

(無題) 削除/引用 No.7459-12 - 2018/12/07 (金) 20:04:34 - 学部4年 おおさん >ちょっと斬新なことを思いついたのですが、それぞれのノックアウトの細胞をネイティブの状態で違う色の蛍光をコバレントにつけたその抗体ラベルして、抗体を洗い落としてから細胞融合したらどうかな。 とても参考になります！ 是非やってみたいと思います！ ありがとうございます。 >あ、両方を認識するような抗体もないのかな？ 片方のタンパク質に対するポリクロがあり、どちらも認識します！

(無題) 削除/引用 No.7459-11 - 2018/12/07 (金) 19:34:44 - おお ＞なにか任意のアミノ酸に標識できる方法など リジンにあとで化学反応でラベルできる人工的なアミノ酸を導入するという方法はあるけどね、、、そのタンパクって細胞外ドメインで片方だけリジンがないとかある？

(無題) 削除/引用 No.7459-10 - 2018/12/07 (金) 19:29:59 - おお あ、両方を認識するような抗体もないのかな？

(無題) 削除/引用 No.7459-9 - 2018/12/07 (金) 19:28:22 - おお >片方ずつのノックアウトはあるのですが、できれば両タンパク質の存在下での観察ができればと思い、質問した次第です。 ちょっと斬新なことを思いついたのですが、それぞれのノックアウトの細胞をネイティブの状態で違う色の蛍光をコバレントにつけたその抗体ラベルして、抗体を洗い落としてから細胞融合したらどうかな。 いろんな懸念は当然出てくるけど。

(無題) 削除/引用 No.7459-8 - 2018/12/07 (金) 15:04:58 - 学部4年 中年さん 説明不足で申し訳ありません。 2種類のタンパク質に対する抗体は現在なく。 互いの相同性が非常に高いので、ペプチド抗体等を使用しないとクロスリアクションが考えられます。しかし、ペプチド抗体の作製はコスト的に厳しいと考えおります。 片方ずつのノックアウトはあるのですが、できれば両タンパク質の存在下での観察ができればと思い、質問した次第です。 ありがとうございます。

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