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(無題) 削除/引用 No.7451-24 - 2020/08/24 (月) 22:22:40 - ちょり エタノールアミンはHClでpH合わせました。調べたらそういうのがいくつかあったので。 ニートの原液って見かけたのですが何のことでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7451-23 - 2020/08/24 (月) 16:28:04 - Lui > 市販のEthanolamineは16.5Mで、pHはアルカリ性を示していますので、 ニートの原液にpHとか何言ってるの？　pHの定義から勉強する。質問はそれから。

(無題) 削除/引用 No.7451-22 - 2020/08/22 (土) 18:25:37 - ちょり 抗体ビーズ作成時のエタノールアミンのクエンチングは3時間やってるそれは本にそのくらいやれと書いてあったものでとりあえずやってるてかエタノールアミンは緩衝能あると思うんだがていうかタノールアミン緩衝液あるよ。

NHSビーズへの非特異的吸着 削除/引用 No.7451-21 - 2020/08/22 (土) 13:23:19 - No more 吸着 NHSビーズへタンパク質をカップリングして、IPする話に便乗させていただきます。 自分はGEのNHSビーズへタンパク質を固定し、Whole cell lysateをIP後、SDS sample bufferで煮沸しております。 銀染色で確認したところ、NHSビーズへ固定したはずのタンパク質と思われるバンドが多数出てきてしまっていて困っています。おそらくカップリングの際にビーズに非特異的に吸着したものが見えてると予想しています。 これを回避する手立てはありますでしょうか？ 調べたところ ・sample bufferで煮沸せずに、もっとマイルドな方法（高塩濃度の溶液等）で溶出 ・NHSを不活化させたビーズでプレクリア（ビーズへ吸着するのは変性タンパクなのでしょうか？未変性タンパクも吸着するなら、プレクリアしても結局NHSビーズに吸着する？） よろしくお願い致します

(無題) 削除/引用 No.7451-20 - 2018/12/06 (木) 01:42:01 - Molarity toto様、引き続きありがとうございます。 > エタノールアミンで20分だけというのは短すぎる気がします。 こういった感覚的なことをお聞きできたのはとても有り難いです。 短いのですね... まず洗浄を厳しく行い、ブロッキングをしっかりしてみようと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7451-19 - 2018/12/06 (木) 01:39:47 - Molarity おお様、条件検討をしており、遅くなりました。 ありがとうございます。 > これはNHSにEthanolamineを反応させて未反応のNHSが残らないようにしているので、これがうまくいってなかったらプルダウンの時に加えたサンプルのタンパクなどがアガロースゲルにコバレントに結合するということで、そういった場合はアガロースげるから外れないので溶出してきません。 おっしゃる通りです。邪魔なバンドが酸性グリシンで溶出されることから共有結合でビーズについているわけではないですね。 > でおそらく直面しているのんすぺの問題は、NHSが関与していない支持体かcontrol Fcとの相互作用だとうとおもいます。 はい、同意します。 ただ抗ヒト抗体にFcタンパク質を付けて、組織抽出液からプルダウンすると邪魔なバンドは落ちてこないので NHSが関与していない支持体にベタベタ付いているのだと考えています。 > ＞抗ヒト抗体ビーズでプルダウンした際 > > このビーズはアガロースですか？ 確認したところ、アガロースでした。 おお先生がおっしゃられるように、界面活性剤で洗ったり、BSAでブロッキングをしたり、塩の濃度を高めるなどしてノンスペを減らせか検討してみます。 > リンクさせるタンパクの量とNHSの比率、反応後結合しなかったタンパク量など計算していますか？そのタンパクがどんなバッファーに溶かしていたのかなどはどうですか？ 計算は、サーモの文書に従ってモル換算して計算しました。 タンパク質はプロテインAビーズで精製したのち、PBSに置換しています。 純度はCBBや銀染色でも確認しましたが、非常に綺麗に精製されています。 ＞　かくにんですが、プルダウンでLysateをいれずバッファーだけのMockではそののんすぺは出ませんよね？もし出るならコピペで示していたWashはやったほうがいいでしょう。 すみません、それは行なっていません。 精製品を銀染色しても、その邪魔なバンドは出ていないので、邪魔なバンドはマウス組織由来のものと考えています。

(無題) 削除/引用 No.7451-18 - 2018/12/05 (水) 22:03:29 - toto よくわかりませんが、エタノールアミンで20分だけというのは短すぎる気がします。ただ確かめたことはないのですが。プロトコール的には1時間やって、その後で、pHを振って洗ったり、Ureaでblockingがてらにwash （抗体がビーズとでなくて抗体同士で結合してることもあるので）して、さらに1MNaClなどで洗うなどして、とにかく抗体がビーズとだけ結合しているようにします。とりあえずは添付のプロトコール通りにされることでしょうが、ただ、やっかいなノンスペのような気もするので、可能なら他の活性化固相もためしたほうが早いかもしれません。意外とNHSよりも超古典的なCNBr活性化アガロースの方がよかったりもします。試行錯誤としかいいようがありません。

(無題) 削除/引用 No.7451-17 - 2018/12/03 (月) 20:02:41 - おお ＞これで作成したビーズでプルダウンしたら、40kdaにコントロールFcでも落ちて来てしまうバンドが現れてしまいました。 かくにんですが、プルダウンでLysateをいれずバッファーだけのMockではそののんすぺは出ませんよね？もし出るならコピペで示していたWashはやったほうがいいでしょう。 あときになるのがNHSにつけたタンパクの精製度ですが、、、

(無題) 削除/引用 No.7451-16 - 2018/12/03 (月) 19:52:31 - おお ＞エタノラミンでa few hours これはNHSにEthanolamineを反応させて未反応のNHSが残らないようにしているので、これがうまくいってなかったらプルダウンの時に加えたサンプルのタンパクなどがアガロースゲルにコバレントに結合するということで、そういった場合はアガロースげるから外れないので溶出してきません。 もしBSAなどでブロックしているなら、万が一Ethanolamineが反応しなかったNHSがあったとしても、BSAがコバレントに結合してくれるのでBSAに相互作用しないものを扱っているならそれでよしともいえるかもしれません。また、Ethanolamine反応後TrisBuffer（５０ｍMぐらいでいい）などに置換しておけばTrisもNHSと反応してくれるのでEthanolamine反応の取りこぼしを拾ってくれるでしょう（もしあったとしても）。 でおそらく直面しているのんすぺの問題は、NHSが関与していない支持体かcontrol Fcとの相互作用だとうとおもいます。 ＞抗ヒト抗体ビーズでプルダウンした際 このビーズはアガロースですか？ まあ抗体では結合しないで大丈夫でFcでは相互作用するというのは可能性としては低く見積もれるかと思えますので、そうじゃないならビーズの支持体の性質に依存しているのでしょう。抗ヒト抗体ビーズがアガロースならアガロースが原因というよりNHS反応生成物による影響が大きいかもしれません。 いずれにしろいまのビーズで進めたいなら、プルダウンの時のバッファーの組成（塩濃度、ｐHや界面活性剤など）を工夫していい条件を見出すのが正攻法かとおもいます。 ビーズを作り直せるなら、リンクさせるタンパクの量を増やしたりして、フリーでEthanolamineと反応するNHSの量が極力少なくするとか、Ethanolamineいがいで反応をとめるとかいくらかやれることがあるのかもしれません。Trisのほうが疎水性が弱くそういう非特異な結合を避けられるかもしれません。 理屈上ありえることを書きましたが、こういう非特異な結合を解消するのは試行錯誤、手探り状態のことがおおいのが現状だと思います。 リンクさせるタンパクの量とNHSの比率、反応後結合しなかったタンパク量など計算していますか？そのタンパクがどんなバッファーに溶かしていたのかなどはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.7451-15 - 2018/12/03 (月) 18:35:19 - Molarity おおさん、ありがとうございます、勘違いしました。 完全にノンスペで結合するバンドを消すことは無理かと思いますが、なんとか50kDのノンスペは消えてもらわないと困るんです... GEのプロトコルではエタノラミンでa few hoursと書いてありました。 私はサーモに従い20分です。 ブロッキングが不十分なのでしょうか？ それともブロッキングは完了していて、その後の工夫次第で除けるものでしょうか。 BSAなどで。、、、

(無題) 削除/引用 No.7451-14 - 2018/12/03 (月) 17:51:08 - おお それはブロッキングではなくWashだと思いますが、、、

(無題) 削除/引用 No.7451-13 - 2018/12/03 (月) 15:01:59 - Morarity プレクリアを試してみましたが、やはり50 kDaのところにFcでも落ちてきてしまいました。 私はこの担体をサーモから購入しましたが、GEヘルスケアのプロトコルを読むと、エタノラミンだけでブロックするのではなく、hi pHとlow pHのアミン系バッファーでしっかりブロックするようなことが書かれてありました。以下がそれです。 To wash the medium after coupling, use a method which alternates two different buffers (high and low pH respectively). Buffers often used are 0.1 M Tris-HCl buffer pH 8 to 9 and 0.1 M acetate buffer, 0.5 M NaCl pH 4 to 5. A suitable procedure could be 3 x 1 medium volumes Tris buffer followed by 3 x 1 medium volumes acetate buffer. This cycle is repeated 3 to 6 times. これを読む限り、かなりがっつりブロッキングしてるかなと思います。 皆様はこれをやられていますか？ 私はサーモのプロトコルに従い、エタノラミンで20分しかブロックしていません・・ 試す価値はあるでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7451-12 - 2018/12/03 (月) 07:19:57 - Morarity totoさん、ありがとうございます！！ なるほど、ありがちという言葉を聞けて良かったです。 プレクリア、ぜひ試してみます。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.7451-11 - 2018/12/02 (日) 15:23:28 - toto NHSのせいかどうかわからないですが、ありがちですね。書かれたようにBSA等でbeadsをブロックする、あるいは抗体を結合させないcontrol beadsを作っておいて、それを入れて前もってlysateを前吸着させて非特異的に結合するものを除いておく、というのが昔ながらの回避法です。特に後者は面倒ですが有効です。

(無題) 削除/引用 No.7451-10 - 2018/12/01 (土) 23:34:01 - Molarity totoさん、 塩酸でよかったのですね、ありがとうございます！ はい、一度失敗しました笑 これで作成したビーズでプルダウンしたら、40kdaにコントロールFcでも落ちて来てしまうバンドが現れてしまいました。このバンドは、抗ヒト抗体ビーズでプルダウンした際には落ちて来なかったものです。 そして私の興味あるバンドは40kdaだったので、そこに非特異的なバンドが今回のNHSビーズで現れてしまって困惑しています。 プルダウンに用いる前に、BSAなどでブロッキングした方がいいのでしょうか...

(無題) 削除/引用 No.7451-9 - 2018/12/01 (土) 23:28:41 - toto ええ。酢酸の方が安全そうですが、普通、塩酸使います。Trisと違ってバッファー作用がないので、失敗はお約束。高価な試薬でないので、pHあわせの練習のようなものです。もっとも、TrisやNH4Clにしても、たいして非特異的吸着が増えるとも思えないですが。

(無題) 削除/引用 No.7451-7 - 2018/12/01 (土) 16:13:26 - Morarity toto様、 ありがとうございます！ 安定に保存できるのですね、安心しました、ありがとうございます。 toto様はHClでpH調製されましたか？

(無題) 削除/引用 No.7451-6 - 2018/12/01 (土) 16:03:52 - toto NHS活性化agarose等のブロッキングに1MのpH7.4溶液は良く使ってきました。書かれたとおりに一度pHを中性にあわせれば、長期間室温で保存できます。何も生えてこないし、ずっと安定に使えます。

(無題) 削除/引用 No.7451-5 - 2018/12/01 (土) 06:16:53 - Morarity はい、そのまま使います。 タンパク質をイモビライズしたビースをスピンダウンし、ビーズのそれ以上の結合能力を失わす目的で1Mエタノラミンを加えて、20分インキュベートするというものです。 サーモのNHS-activated agaroseのことです。 >[Re:4] おおさんは書きました : > そもそも１Mをそのまま使うの？それともストックSolutionでなんかのバッファーにいれて使うの？後者ならpHの調整は必要ないでしょうし。あるいは終濃度に合わせて濃いバッファーにすることもありだし。 > > pHの合わせ方は色々あるので目的によりけりだと思うけど。例えばリン酸を加えていけばリン酸ーエタノールアミンバッファーになるし。

(無題) 削除/引用 No.7451-4 - 2018/12/01 (土) 06:10:26 - おお そもそも１Mをそのまま使うの？それともストックSolutionでなんかのバッファーにいれて使うの？後者ならpHの調整は必要ないでしょうし。あるいは終濃度に合わせて濃いバッファーにすることもありだし。 pHの合わせ方は色々あるので目的によりけりだと思うけど。例えばリン酸を加えていけばリン酸ーエタノールアミンバッファーになるし。

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