全56件 ( 41 〜 56 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. 3. /3

(無題) 削除/引用 No.7441-16 - 2018/11/29 (木) 18:15:56 - AP 蛇足ですが、 ライゲーション後のエタノール沈殿は、エレクトロポレーションのときは電導性をできる限り低くするひつようがあり、脱塩をするため。

(無題) 削除/引用 No.7441-15 - 2018/11/29 (木) 18:13:49 - AP エレクトロポレーションのほうが効率いいですよ。 ・ケミカル法だと大きなサイズのプラスミドが苦手で、おおむね10 kbを超えるといきなり一桁、二桁効率が落ちますが、エレクトロポレーションなら影響は小さい。 ・ケミカルのコンピーテントセルを作るよりはるかに簡単にそれ用の細胞を調製できる。普通に培養して対数増殖期に集菌、純水で洗浄して凍結保護剤としてグリセロールを混ぜた純水に懸濁するだけ。培養も手順も試薬もシンプル。これに比べたら井上法なんて、ものすごく面倒くさい。 ・ケミカルコンピと違って、凍結保存中に性能が落ちにくい。

(無題) 削除/引用 No.7441-14 - 2018/11/29 (木) 16:36:00 - ついでの質問 Ligasionの後エタ沈してエレクトロポレーションって、ヒートショックより効率はいいものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7441-13 - 2018/11/29 (木) 12:45:56 - AP 蛇足ですが、 >生えてきたコロニーをプラスミド抽出して、そのプラスミドをXhoIで制限酵素消化後確認泳動を行ったところ、目的の位置よりも低い位置にバンドが見えました。pET-23aを制限酵素消化せずに泳動したところ、同じ位置にバンドが見えたことからpET-23aがセルフライゲーションしたものがスーパーコイルとして見えたのではないかと考えています。 Sal1末端とXho1末端がライゲーションすると、どちらの酵素でも切れない配列になりますから、ccc のままのこるんですね。

(無題) 削除/引用 No.7441-12 - 2018/11/29 (木) 12:04:05 - おお 個人的には両方向に入る可能性があるコンストラクトやブラントなどもやったことがありますので、今あるデザインでベクター側を脱リン酸化してしまえばいいんじゃないと思ってます。とくに切ったベクターとインサートまだ残っているならそこからそんなにステップ踏むわけじゃないし。

(無題) 削除/引用 No.7441-11 - 2018/11/29 (木) 11:03:26 - AP 両端同じ切り口でどちらの方向にもクローニングされうるというのも、役に立つことがあって、 例えば、このように発現ベクターに入れるような場合、 入れた遺伝子がleaky expressionした産物が宿主に毒性で、正しく組み上がったベクターの形質転換体ほど生えなくなるということが起こりがち。 これが正方向にのみライゲーションされるdirectional cloningだと、ライゲーションまでの過程でうまく行っていないのか、それは問題なくて毒性で生えてこないのかなかなかわからない。 こういうとき、どちら方向にもクローニングされるデザインだと、正方向は取れないで逆方向ばかり取れるので、毒性が原因だなと見当がつく。

(無題) 削除/引用 No.7441-10 - 2018/11/29 (木) 10:30:05 - Ca >[Re:5] APさん ご返信ありがとうございます。 > プライマーにSalIとXhoIを仕込んでおいたってことかな？　directional cloningのために。 その通りです。説明不足で申し訳ありません。 他の方のご指摘でもあるようにデザイン設計がダメな設計のようですね。

(無題) 削除/引用 No.7441-9 - 2018/11/29 (木) 10:21:00 - Ca >[Re:2] おおさん ご返信ありがとうございます。 脱リン酸化について勉強させていただきます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7441-8 - 2018/11/29 (木) 10:18:50 - Ca >[Re:2] カートン箱さん ご返信ありがとうございます。 わかりやすいサイトを教えていただきありがとうございます。 やはり制限酵素の問題が大きそうですね。 終止コドンなどの方は確認したところ大丈夫そうでした。

(無題) 削除/引用 No.7441-7 - 2018/11/29 (木) 10:18:09 - おお https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cloning-guide Dephosphorylation Dephosphorylation is sometimes necessary to prevent self ligation. NEB offers three products for dephosphorylation of DNA: Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) (NEB #M0371) and Antarctic Phosphatase (AP)(NEB #M0289) are heat-inactivated phosphatases. Both work in all NEBuffers, but AP requires that the reaction be supplemented with Zn2+ Calf Intestinal Phosphatase (CIP) (NEB #M0290) is a robust enzyme that will function under many different conditions and in most NEBuffers. However, CIP cannot be heat inactivated and requires a purification step before ligation. タカラ、ニッポンジーン、東洋紡なども多分分子生物学用アルカリフォスファターゼを売っているだろうし、ガイダンスなどもあると思うので勉強してみてください。

(無題) 削除/引用 No.7441-6 - 2018/11/29 (木) 10:10:09 - Ca >[Re:2] PYKさん ご返信ありがとうございます。 SalIとXhoIで切断するとセルフライゲーションが起こることは全く考慮に入れておりませんでした。 実は、ラボのボスに自分で設計してみてといわれて、自分で設計したためにこのようなミスをしてしまいました。 脱リン酸化処理も知識不足で申し訳ないですが、知らなくて行っていません。

(無題) 削除/引用 No.7441-5 - 2018/11/28 (水) 18:40:17 - AP >TAクローニングによってpGEM-T-easyベクターに入れました。 その際、SalIとXhoIを用いて入れました。また、シークエンスを行って問題ないことを確認しました。 TA-cloningなら「SalIとXhoIを用いて入れました」ってことはないよね。 confuseしているんかな。 プライマーにSalIとXhoIを仕込んでおいたってことかな？　directional cloningのために。だとしたら、トホホな実験デザイン。他の人も指摘しているけれど、XalIとXhoIは切り口が同じだたからどちら向きでもライゲーションされる。それじゃどちらかシングルの酵素で入れようとするのと変わらない。これは、スーパーバイザーの責任だろうけど。

(無題) 削除/引用 No.7441-4 - 2018/11/28 (水) 17:11:25 - おお ベクターの脱リン酸化処理してなかったらそうなるよね。 http://www.cc.kochi-u.ac.jp/~tatataa/tech2003/gene/restriction.html してたらごめん。

(無題) 削除/引用 No.7441-3 - 2018/11/28 (水) 17:05:46 - カートン箱 PYKさんの指摘が一番可能性が高そうに思えますね。 SalIとXhoIは突出末端の配列が同じ（コンパチ）なので、SalIで切った末端とXhoIで切った末端は、脱リン酸化処理していなければLigaseでくっついてしまいます（同じミスをしたことがあります）。 突出4塩基で端の2塩基が相補しただけでもつながることがあるらしいので、要注意ですね。 どのような制限酵素がコンパチになるかはTaKaRa等のサイトに詳しいです。 ↓ http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?catcd=B1000359&subcatcd=B1000360&unitid=U100003629 他、発現用ベクターとインサートをつないだ時の、インサート開始コドン直前の配列設計が個人的に気になります。 プライマー設計やクローニングサイトの都合上、開始コドンをインサートの5'末端にすることは少ないと思いますが、つなぎ方によっては開始コドンの前に新たな開始コドンができたりします。 かつて「開始コドン前に終始コドンをうっかり作ってしまい、形質転換体が何も生産しない」というミスをやらかしたことがあるので、気になった次第です。

(無題) 削除/引用 No.7441-2 - 2018/11/28 (水) 16:44:18 - PYK まあ、色々と指摘したいところが多いけど、まずはSalIとXhoIで切断するとセルフライゲーションする確率がだいぶ高くなると思いますが。 脱リン酸化処理をしたのなら、まあいけなくはないけど。

TベクターからpET23aへのベクター入換について 削除/引用 No.7441-1 - 2018/11/28 (水) 16:39:38 - Ca はじめて投稿させていただきます。 某大学の研究室へ分属して1年ほどたつものです。 研究室ではラットのあるプロテアーゼの発現精製をすべく、そのプロテアーゼの遺伝子(約2000bp)をPCRで増幅し、シグマのゲル抽出用キットによって抽出してTAクローニングによってpGEM-T-easyベクターに入れました。 その際、SalIとXhoIを用いて入れました。また、シークエンスを行って問題ないことを確認しました。 そして現在、プロテアーゼの遺伝子をタンパク質発現用ベクターのpET-23aへ入れ換えようとしています。 具体的には、先ほどのTベクターとpET-23aどちらも1μg分をSalIとXhoIで制限酵素消化3時間行い、泳動、切り出しを行いました。 確認泳動後、バンド強度からモル比がpET：インサート=1：3になるようにライゲーションを行いました。この際、TaKaRaのT4 DNA Ligaseを用いて16℃、16時間反応させました。 反応後、エタノール沈殿を行い、エレクトロポレーション法(1.5kV)でDH5αに導入してLB(amp)プレートに植菌しました。 生えてきたコロニーをプラスミド抽出して、そのプラスミドをXhoIで制限酵素消化後確認泳動を行ったところ、目的の位置よりも低い位置にバンドが見えました。 pET-23aを制限酵素消化せずに泳動したところ、同じ位置にバンドが見えたことからpET-23aがセルフライゲーションしたものがスーパーコイルとして見えたのではないかと考えています。 3回ほど行ってみたのですが全て同じものになりました。 長々と拙い文章を並べてきましたが、この現象についてご教授していただきたく書き込みました。 情報として足りない部分もあるかと思いますが、よろしくお願いいたします。

全56件 ( 41 〜 56 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. 3. /3

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---