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(無題) 削除/引用 No.7441-57 - 2018/12/07 (金) 08:25:32 - おお ＞> そらそうですが、２、３百ベースでとなるとそうも行かないでしょう。 ＞＞そらたしかにいつもいつも基本通りに出来る条件が揃うとは限りませんが、といってやっぱり繋ぐときに使った制限酵素だけを使わなきゃならんということもないし、制限酵素サイトが山ほどあるであろう4bpカッターを使わなきゃならないような条件もそうそうないでしょう。 ２、３百bpをよく使うなら６ベースカッターがなく制限酵素を使った確認は結構悩みます。Ligationの両端のsiteを工夫すればいいかもしれませんができないことも結構ありましたので。PCRで方向を決定するのは手ですが、PCRがそういうのにメジャーじゃない頃からやってましたので、、、 >> インサートがそのまま切り出される場合インサートのバンドのインテンシティーが倍になるので、他のポジのクローンなどと比較するとわかるといえばわかります。 >これ、理屈の上ではそうなんですが、結構面倒だと思います（面倒でした）。 確かに完璧な方法論でもなく、パット見でタンデムにつながっていそうなものを排除しておこうということです。１０個程度ひろってミニプレップすればちゃんとDNA量を揃えてなくても幾らかのペアーや複数のクローンでComparableなものはあるので、そこで比較すれば結構顕著です。またタンデムにつながる確率は非常に低いので（長くなればなるほど低いだろうと勝手に想像していますけど）その程度の見分け方でまずはそういう怪しいもの、比べられないものを選ばないでおけばあとでしっかりと確認は必要でしょうけど、間違ったものを拾うことはないだろうと言う程度のことです。だからその結果で、すぐに２個ぐらいラージプレップに持っていって、その時確認したとしても怪我することはないだろうという程度の話です。

(無題) 削除/引用 No.7441-56 - 2018/12/07 (金) 08:17:42 - おお すこし見ない間に随分話が進んでいるみたいでフォローできていないのですがまず、No.7441-30このあたりから、、、 コンピの自作についてはもう色々意見が出ていますがどれくらいポピュラーかは置いといて、やはり短いのが入るが、２、３kbpになると苦労しているというようなケースの相談は結構こちらで見てきました。 研究室の方針、研究の方向性（バクテリアで研究しているならそのへんにこだわりがあるかもしれませんし）、頻度などでそれぞれのラボが決めているのだろうと思います。とくに分子生物学的手法を会得していない学生などにもやってもらうことになると、なんだかんだと失敗してどんどんコンピを消費するという事もあるでしょうし。 また、人の感覚を否定して云々という指摘もありましたが、それは私も認めないといけないのかもしれません。市販コンピでいい状態でやる上では２、３kbpはそんなに実用上効率で問題になることはないというのはそうしている人の感覚で、実際には参考になる意見です。 で５００bpは入るけど２、３kbpでうまく行かないというのがコンピが悪いからという指摘もあります。ちょっと理屈っぽくなるけど敵意はないので多めに見てほしいですが、 ５００bpぐらいのものばかり導入していて、長いものを扱わないなら売っているハイコンピテンシーのものほど良くなくても十分だし、そういう研究してでは決して悪いコンピとはいえないとおもいます。 もう一つはコンピテンシーが低くなると２、３kbpぐらいでも効率が悪くなって場合によっては使いものにならないということは、長いほどTransformation効率が低くなりそれはおそらくコンピテンシーがあがってもそうだろう（もちろん実用的には遜色ないという意見もいただきましたのでそれを今後考慮していこうとおもいますが）と思えるというのがそういう例を出した理由です。この点については他の人の意見も聞ききたいと思います。どちらが正しいというよりある意味興味といろいろな意見があったほうが考えがまとまりやすいと思いますので。 じつは結構昔はコンピを買わないラボにいてそういう情報をもとに自身で実験を組み立ててきましたので効率良いコンピであっても自分の方法論でやってきましたので、そこにおいてあまり情報を持ってませんでした。私はバックグランドを減らすためにプラスミドの量を５ナノぐらむとかそれ以下でやりますので。それで、プラスミドのセルフライゲーションの可能性があるときはアルホス処理をした上でインサートの量を通常のプロトコールより過剰になるところまで３段階ぐらいでふってLigation、Transformationをやってます。この場合でも過剰に入れたほうがコロニー数が減るけど、ポジの割合が高くなるので（かなりのケースで８０％以上という感覚）その後のインサート確認が楽になります。三個拾えばいいかくらい。

(無題) 削除/引用 No.7441-55 - 2018/12/07 (金) 02:04:45 - ligation >中年さん > その使用頻度なら私も買うと思います。 ありがとうございます。技術の習得という意味では作るのに興味が全く無いわけではないのだけど、先に書いたとおりの理由で、うちくらいの使用頻度ならやっぱり購入しますね。 野島先生の話は知りませんでした。10uLずつの分注、気をつけて作業すればこれくらいでもきちんとワークするのでしょうね。自分のラボでは1チューブに45uL入れて、ligation mixtureを5uL使っています。もっと節約する余地があるということだと思います。ただ、コンピテントセルはラボで共有していて、まだ経験が少ない人、いくら言ってもあまり気をつけない（教えた当初はきちんと氷上で溶かしていたのが、油断してたら手で握って溶かし始めたりとか）人もいるので、あまり小さいボリュームにするのが怖かったりします。45uLなんかすぐ溶けるのですが、10uLなら更に早く溶けるだろうから、逆に良いだろうか……。まあ、私が見た、手に握られてたというのは分注前のチューブなんですけど。

(無題) 削除/引用 No.7441-54 - 2018/12/06 (木) 18:44:44 - opq またウザいのが追加で参戦してくるっていうｗ

(無題) 削除/引用 No.7441-53 - 2018/12/06 (木) 16:17:06 - AP 手技の変遷みたいな話になってしまいしたが、 最初の方に補足しましたが、今は、プラスミドベクターは切り出して精製しているので、PCI抽出の出番はなし。 制限酵素消化のときにAPも入れておいて同時にインキュベート。 切り出しをルーチンにするようになったのは、アルカリ法で精製した制限酵素の完全消化は不可能に近いことがわかったから。これも今では常識に近いと思うけど、当時は少量サンプルを泳動して未消化バンドが見えなければオッケーだと思われていた。 ugのプラスミドにpgオーダーの切れ残りがあっただけでも、そうとうな数の大腸菌を形質転換できる。そのバックグラウンドが問題にならないくらい調子のいい実験もあるけれど、ちょっと難度が高いライゲーションにあたるととかなりじゃまになる。だから最初から、基本ゲル切り出しをやることに決めてます。 そういうこともあって、AP処理を加えることになんら余計な手間もない、というのが現状。

(無題) 削除/引用 No.7441-52 - 2018/12/06 (木) 16:04:33 - AP >じゃなくて、わざわざ「単純に等量(ng）をゲルに流してだと」と書いてるところがミソでしょ。 だから単純にそういうふうに見るんじゃないということを言ってくる。

(無題) 削除/引用 No.7441-51 - 2018/12/06 (木) 16:03:29 - AP >大多数＝普通＝当たり前なんて謎変換するような国語力の人にそこに気付けというのが無茶だったかな？ 辞書みろよ。語義は一つじゃないぞ。 それと、ちゃちゃ入れるだけなら出てくるな。 ディスカッションの場だ。

(無題) 削除/引用 No.7441-50 - 2018/12/06 (木) 15:56:12 - 国語力の低下 長々と書いてるけど、そんなのligationさんも百も承知でしょ。 じゃなくて、わざわざ「単純に等量(ng）をゲルに流してだと」と書いてるところがミソでしょ。 大多数＝普通＝当たり前なんて謎変換するような国語力の人にそこに気付けというのが無茶だったかな？

(無題) 削除/引用 No.7441-49 - 2018/12/06 (木) 15:12:19 - AP >これ、理屈の上ではそうなんですが、結構面倒だと思います（面倒でした）。単純に等量(ng）をゲルに流してだと見れない場合の方が多いんじゃないかなあと思いますが、おおさんは実際にこれで比較されたことありますか？ おおさんじゃないけれど、これは基本のテクニックで、 未知のＤＮＡクローンの制限酵素地図を描こうというときなど、ダブレットなんかはちょくちょく出てくるわけ。 あるDNA分子を切断すると、断片の分子数は同じ、ということは断片長とバンドに含まれるDNA量が比例関係、でEtBrの染色強度もほぼ相関するわけ。 てことは、一つのレーンで長いほど濃く、短いほど薄く染まる、グラディエントになる。ところがそのグラディエンドを乱すように突然濃いバンドが現れたりすると、ははーこれはダブレットだな、ってわかるわけ。 バンドが３本以上あれば、突出して濃くなっているバンドはわかるし、ベクターとインサートの二本しかなくても、ダブレットどそうでないのとでベクターの濃さに対するインサートの濃さはの違いは区別できる。 まあ、これはEtBrは先染めでしかやらん、1-kb ladderでバンド濃度を揃えてあるマーカーしか使ったことない、lambda Hind3やらlambda Sty1やら何のことかわからん、という人には感覚がわからんかもしらん。

(無題) 削除/引用 No.7441-48 - 2018/12/06 (木) 14:31:42 - AP 訂正します 「まあ、コンピは買ってるラボの方が大多数を占めるというなら、Molecular Cloningみたいは実験書にページが割かれることもないでしょう」 熱失活とフェノール抽出の比較はしたことないですけれど（精製方法のアップグレードなので少なくとも悪くはならないはずですから）、熱失活だけで十分できていたところで、（単純に飛ばしてしまってだけど）脱リン酸化を省くとどうなるかは経験済み まあ、脱リン酸化もその後の精製も実験手技の中じゃ大した手間だとは思わないので。それでいて労力、費用を含めてコストにたいする効果は高いですし。あえて冒険するところではないですな。何を重視して実験デザインをするかだけど、 気が向いたら、methodology系の雑誌にインサート大量で脱リン酸化なしライゲーション法でも投稿してくださいよ。認知と支持が得られればあなたも満足でしょう。

(無題) 削除/引用 No.7441-47 - 2018/12/06 (木) 14:22:19 - 国語力の低下 「日本に住んでいる人の大多数は大和民族である」 が 「日本に住んでいる人なら大和民族であるのが当たり前」 に変換されたようなものだな。そりゃ止めて下さい言うわ。

(無題) 削除/引用 No.7441-46 - 2018/12/06 (木) 14:12:35 - 中年 その使用頻度なら私も買うと思います。 古い日本語のプロトコル集で井上法の開発者の野島先生が、最も安上がりなのはTOYOBOからコンピテントセルを買って、気をつけて１本解凍し、よく冷やしたチューブに10 uLずつ分注して再度、液体窒素で凍結。この再凍結で効率は一桁も落ちないので、これにligation mixtureを1 uL入れて形質転換に使うことだ（どうせ山ほど形質転換体が出るのだし）、そうすれば１パック買えば100回使えるのだから、とお書きになっているのを読んで感心したことを思い出しました。蛇足ですが。

(無題) 削除/引用 No.7441-45 - 2018/12/06 (木) 13:52:15 - AP おなじこった。 大多数であるとおもう、ということはそれが普通だと思っているってことでしょ。あたりまえは普通の同義語。

(無題) 削除/引用 No.7441-44 - 2018/12/06 (木) 13:30:21 - ligation >中年さん 返信ありがとうございます。あれから調べてみたら、過去二年で自分がいるラボで作成したベクターは40個弱、特段多くはないけれど、少なくもないというところだと思います。そして、コンピテントセルに使った額は$600弱程度でした。日本でだとどれ位の額になるかわかりませんが、大雑把に2倍程度として10万円超程度。年間で5万円分位。コマーシャルのは安定した品質が期待できる（まあ、それこそ慣れてる人からするとこれは問題にならないんだろうけれど、しかしこの掲示板でも昔「自作したコンピテントセルの効率が低くて困ってます」というトピが立ったことがあったと思う）」こと、材料費（安いとはいえそれでもゼロではない、分注するのに使うチューブとか諸々含めて）と作成に取られる時間（人件費。これが大きい）と色々考えると、この程度ならやっぱり自分は買うかなあ、と思います。しかし、中年さんが仰る通りで、それは自分が自作するのが当たり前の環境にいなかったからでしょうね。もしそういう環境で育っていたら、5万円分を簡単に浮かせられるのだしと自作していたかもしれません。 >APさん 買うのが「あたり前」と書いたんじゃなくて、「買ってるラボの方が大多数を占めると思う」です。だいぶニュアンスが変わるので、そういう変換の仕方はしないで貰いたいです。 要するに、両方法でどっちがマシか実際に比較した経験はないし、さらには「熱失活だけだとどれほどアウトプットを下がるかまでは、検討」したこともない、ということですね。なるほど、よくわかりました。

(無題) 削除/引用 No.7441-42 - 2018/12/06 (木) 11:10:53 - AP いつも思うんですけど、APさんって「謝ったら死ぬ病気」なんですか？

(無題) 削除/引用 No.7441-41 - 2018/12/06 (木) 10:42:59 - AP まあ、コンピは買うのがあたりまえっていうなら、Molecular Cloningみたいは実験書にページが割かれることもないでしょう。 CIAPはかつては熱失活が可能と考えられていました。 私が教育を受けたラボでも、その利点から熱失活困難なBAPからCIAPに切り替えた経緯があります。CIAPの熱失活は不完全、あるいは可逆的ってのはあとから出てきた話で、それまでは普通に熱失活でやっていて、それでもできてましたから。熱失活だけだとどれほどアウトプットを下がるかまでは、検討していない。

(無題) 削除/引用 No.7441-40 - 2018/12/06 (木) 09:20:07 - 中年 うちはごく小さな世帯です。コンピテントセルを作るのは年に１回くらいでしょうか。自作するかどうかは単なる文化の違いで、作るのが当たり前という環境にいれば自ずとそうなるのだと思います。年度末にお金が余って使いみちを探さないといけないような裕福なラボなら、あるいは大腸菌のトランスフォーメーションをやるのが年に数回のみというなら、自作するのはたしかに時間の無駄でしょうね。

(無題) 削除/引用 No.7441-39 - 2018/12/06 (木) 01:16:55 - ligation > 自分は主観を交えて書き込むけど、他人が主観を交えた書き込みは許しませんっていうね。 いや、他人の主観の話は、経験談なりなんなりも入っている場合は非常にありがたいですよ。おおさんもAPさんも、長いインサート（ベクター）を扱った時に、へたったと思われるコンピテントセルを使うとうまくいかないのが、フレッシュなものに変えたらうまくいくことがある、と仰っていて、そういうこともあるのかなと記憶しておこうと思っています。 ただ、長いインサートだとライゲーション効率が落ちるは私はどうも都市伝説なんじゃないかと思っていて、これはコンピの話は別の話しだということと。それと、へたったコンピを使わなきゃならない状況に陥るのがそんなに日常的にあるかなあ、とも思っている。後者に関しては、コンピ自作ラボが大多数を占めるなら有り得る話だから自分の認識を改めないといけないと思っています。

(無題) 削除/引用 No.7441-38 - 2018/12/06 (木) 00:55:58 - ligation コンピの自作の件は確かに私の偏見が入っているかもしれません。私は自作したことがないし、知り合いで自作している人の数もかなり限られている。大雑把にここ10年で学位を取った知り合い100名程度の中では、自作の経験がある人はビッグラボ（20人程度以上、かなあ）出身の2〜3名しかいない。スケールメリットを享受できる環境、あるいは、研究内容的に極端に大量のトランスフォーメーションが必要なラボでもなければ、大量に作っても腐らせる（比喩的表現）だけだからだと思います。中年さんやAPさんのところはどうでしょうか？やはり大きいラボじゃないですか？それとも、今の日本では小〜中規模のラボでもどこでも作ってるものでしょうか？意味無いように思うのですが……。 >APさん 出来れば先の私の質問に答えてもらえるとありがたいです。「失活が完全でないとしてもCIAP後、熱失活処理をしてやったほうがマシな気がする」、これやったことあります？

(無題) 削除/引用 No.7441-37 - 2018/12/05 (水) 20:54:13 - opq 自分は主観を交えて書き込むけど、他人が主観を交えた書き込みは許しませんっていうね。

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